(完整版)生活饮用水标准检验方法_微生物指标[1]

不得检出
水质非常规指标及限值
修订前
微生物指标
限值
-
-
修订后
微生物指标 贾第鞭毛虫/（个/10L） 隐孢子虫/（个/10L）
限值 <1 <1
小型集中式供水和分散式供水部分水质指标及限值
修订前
微生物指标
限值
-
修订后
微生物指标 菌落总数/（CFU/100mL）
限值 500
生活饮用水水质参考指标及限值
修订前
定义：用提高培养温度的方法将自 然环境中的大肠菌群与粪便中大肠 菌群区分开，在44.5℃仍能生长的
大肠菌群,称为耐热大肠菌群。
四、大肠埃希氏菌
检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法 ➢大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大 肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h产生β-葡萄 糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生 特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：EC-MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。 培养条件：44.5±0.5℃ 培养24±2h。紫外灯：波长366nm，功率6W 大肠杆菌能产生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产 生蓝色荧光 ➢滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜 在含 有荧光底物的培养基上培养，能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释 放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测 水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：NA-MUG
Cryptosporidium 隐孢子虫生活周期
子孢子
滋养体
Ⅰ型裂殖体
裂殖子
裂殖子
成熟卵囊
合子
雌、雄配子体
Ⅱ型裂殖体
Cryptosporidium 隐孢子虫(染色后荧光显微镜下)
Giardia 贾第鞭毛虫 ➢ 特点:单一细胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和
双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫
培养基：ONPG-MUG
结果判定：水样变黄色同时在366nm的紫外光下产生蓝色 荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为 阳性。
五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫
贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体 内的肠道原虫，可致人兽共患病。患此病的人和动物 从粪便中排出大量的卵(孢)囊污染环境，在地面水和 防护差的地下水及处理不良的自来水中都可检出卵(孢) 囊。随着社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在 的危险因素加以限制很有必要。在此基础上，新标准 中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法。
微生物指标 限值 -
修订后
微生物指标 肠球菌/（CFU/100mL） 产气荚膜梭状芽胞杆/（CFU/100mL）
限值 0 0
一、菌落总数
修订前
修订后
细菌总数
菌落总数
原理：细菌总数是指水样在一定 定义：水样在营养琼脂上有氧条 条件下培养后（培养基成分、培 件下37℃培养48h后，所得1ml水 养温度和时间、pH、需氧性质等） 样所含菌落的总数。 所得1ml水样所含菌落的总数。按 本规范规定所得结果只包括一群
培养条件：36±1℃ 培养4h 紫外灯：波长366nm，功率6W
➢酶底物法定义：在选择培养基上能产生β-半乳糖苷酶分 解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产 生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落 能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃 希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。
➢ 易感人群：3岁以内婴儿；免疫功能受损害者；旅游者。
重要的动物宿主
➢贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包括两栖动物；鸟类； 哺乳动物在内的40多种动物均可成为贾第鞭毛虫的宿 主。
➢调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠 及大鼠等动物感染。
➢一些生活在水中的动物可被来源于人的贾第鞭毛虫孢 囊感染，因此这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾 第鞭虫的传播媒介。
FiltaMax Xpress 快速淘洗装置
压缩 空气
滤器＋滤芯
Filta-Max xpress快速法淘洗流程
❖ 滤器（带滤芯）放入淘洗装置 ❖ 淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机 ❖ 加 4.0 巴(58 psi)压缩空气 ❖ 按动F1钮 ❖ 2分钟后收集400ml淘洗液 ❖ 快速全自动
淘洗液收集
3.离心浓缩
能产生β-半乳糖苷酶的细菌群组分解ONPG使培养基呈黄色 酶底物法的主要特点： 优点： ➢可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌 ➢检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h ➢无需确证试验 ➢操作简单，对试验条件和人员要求低 缺点： ➢检测成本高
总大肠菌群三种方法的比较
时间 验证试验 步骤 特殊设备 价格
Cryptosporidium 隐孢子虫
➢特点:单一细胞原生动物，约3-7m 。有微小隐孢子虫、 鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内的 主要为微小隐孢子虫（C．parvum）。 ➢宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类 ➢感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染的动物体肠道内，卵 囊通过粪便排出体外污染环境。 ➢易感人群：免疫缺陷者（如爱滋患者）、儿童、老人、医 务人员等 ➢传播方式:以粪-口，手-口途径为主，污染的水源和空气 均可传播。
在滤膜上,将滤膜贴在选择培养上, 膜过滤水样, 将滤膜贴在添加乳
经培养后,计数生长在滤膜上的典 糖的选择培养上, 37℃ 培养24h，
型大肠菌群菌落数。
能形成特征菌落的需氧和兼性厌
培养条件：37℃ 18-24h
氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检 测水中总大肠菌群的方法。
培养条件：37℃ 24±2h
酶底物法
MPC-S磁极
MPC-1磁极
5.免疫磁珠与孢（卵）囊复合物的分离
60min
5min
10min
染色镜检
6.染色及镜检
单克隆免疫荧光染色（FA-异硫氰酸荧光素） 或 DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色 荧光显微镜（Differential Interference
能在营养琼脂上发育的嗜中温的 需氧的细菌菌落总数
培养条件：36±1℃ 24h
36±1℃ 48h
二、总大肠菌群（埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷 伯氏菌属、肠杆菌属）
除多管发酵法、滤膜法外，增加了酶底物检测方法
修订前
多管发酵修法订后
多管发酵法原理：总大肠菌群系指一 总大肠菌群定义：总大肠菌群指一群 群在37℃ 培养24h能发酵乳糖、产酸 在37℃ 培养24h能发酵乳糖、产酸产 产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性 气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无 无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜 芽胞杆菌。 粪便，具有指示菌的一般特征，故以 此作为粪便污染指标评价饮水的卫生 质量。
1.将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心力下，离心15min。慢慢地减速 ，（不能使用制动装置！）以免搅起沉淀物。
2.用吸气装置将沉淀物上层8-10mL处的悬浮物小心吸出 （吸气装置的真空应小于3.3kPa）。
捕获原理:
4.免疫磁珠捕获
标记A抗体的磁珠
具有A抗原的C/G
DYNAL MIX 1混 合器
Giardia lamblia。在不同温度和纬度地区均能发现该病；
发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高达到2030%。 可引起急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童的生 长发育。
➢ 传染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人带孢囊全家 感染；
➢ 传播:通过被污染的水和食物经口传播；接触（往往一人 带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。
修订后的标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总 大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和 隐孢子虫。
同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆 菌。
水质常规指标及限值
微生物指标
修订前
限值
修订后
微生物指标
限值
细菌总数 100 CFU/mL
菌落总数/（CFU/mL）
100
总大肠菌/（MPN/100mL或
多管发酵法 24-72h 需要 较繁 显微镜 低
滤膜法
酶底物法
24-48h 需要
24-28h 不需要
较简便
简便
显微镜、过滤设备 压膜机
低
较高
三、耐热大肠菌群（埃希氏菌属、耐热克雷伯氏菌）
检测方法：多管发酵法、滤膜法
修订前
修订后
原理：用提高培养温度的方法将自
然环境中的大肠菌群与粪便中大肠 菌群区分开，在44.5℃仍能生长的 大肠菌群,称为粪大肠菌群。
1.水样过滤
水样从两侧流经压缩的海绵膜汇集至中孔 “两虫”在滤芯表面被捕获
水样流向
滤器连接套件
滤器 滤芯（过滤模 块）
2.洗涤(淘洗)滤芯
➢ 洗涤管 ➢ 滤芯置于洗涤管,并将
滤芯下部的压缩固定锣 栓解除 ➢ 周律性地压缩/扩展海绵滤 芯
洗涤(淘洗)装置
过滤器
500ml锥 形离心瓶
Filta-Max®手动淘洗装置 Filta-Max®自动淘洗装置
酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体 使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。 培养基：MMO-MUG培养基（Minimal Medium ONPG-MUG）。 本方法可分为定性和定量。 定量法：10管法、51孔定量法 培养条件： 36±1℃ 24h
Βιβλιοθήκη Baidu
过滤器
滤芯
FiltaMax Xpress 快速系统-滤器及滤芯
Filta-Max : 滤芯结构（手动/自动法）
❖ 60 层环状海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔)
❖ 从60cm 压缩成 3cm ❖ 螺栓固定
Filta-Max xpress:快速法滤芯结构
❖ 40 层海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔) ❖ 39层海绵: 40mm x 10mm (18mm中孔) ❖ 交互叠放 ❖ 从79cm 压缩到 3cm ❖ 螺栓固定
总大肠菌群 每100mL水样中不得检出 CFU/100mL）
不得检出
耐热大肠菌/（MPN/100mL
粪大肠菌群 每100mL水样中不得检出 或CFU/100mL）
不得检出
游离余氯
在与水接触30min后应不 大肠埃希氏菌/
低于0.3mg/L,管梢末水不 （MPN/100mL或
应低于0.5mg/L
CFU/100mL）
—U.S.EPA
两虫的检测方法（免疫磁分离荧光抗体法） 检测程序： 水样过滤 洗涤 离心 免疫磁珠捕获卵囊 磁珠与 卵囊复合物的分离 荧光标记和DAPI染色 显微镜检 查记述 结果报告 检测问题： ➢方法操作复杂 ➢检出率低 ➢无法进行生物活性判定 ➢不能进行属、种鉴定 ➢价格高
IDEXX Filta-Max® 手动/自动系统 －滤器及滤芯
生活饮用水卫生标准GB5749-2006 生活饮用水标准检验方法GB5750-2006
微生物指标及微生物检验的介绍
广东省CDC微生物检验所 严纪文
我国旧的饮用水水质标准是1985年颁布实施的GB574985，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外的饮用 水标准相比，主要差别在于微生物指标项目少，缺少有机 物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠 菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。
Giardia
贾第鞭毛虫
两虫感染的特点 ➢贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium) / 感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素 无效，治疗依赖于自身抵抗力 ➢大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大 部分地下水都有被地表水污染的潜在危险 ➢可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已 成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化 消毒有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能 完全去除 ➢饮用水高温煮沸也并非有效 对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高
结果：5个10ml 管中阳性管数为0时， 结果：5个10ml 管中阳性管数为0时， MPN值为0（主要针对出厂自来水或 MPN值<2.2 需每天检验一次的水样）
滤膜法
修订前
修订后
滤膜法原理：用孔径为0.45μm 滤膜法定义：总大肠菌群滤膜法
的微孔滤膜过滤水样,细菌被截留 是指用孔径为0.45μm的微孔滤
隐孢子虫感染案例
1993 年在美国威斯康星州的东南 部港口城市密尔沃 基暴发 400,000 人被Cryptosporidium感染，4,000人到 医院 就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎的饮 用水。
1996 年美国CDC将 Cryptosporidium感染列入国家必 须申报的传染病名单，2002年将 Giardia 感染列入国家 必须申报的传染病名单