细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告

工业微生物育种实验

细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定

关于菌株的几个概念：

野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。

营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。

原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同

关于培养基：

基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。

完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用[＋]来表示。

补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。

摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。

关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法

一、实验目的

1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。

2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。

二、实验原理

筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。

本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。

三、实验器材

离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针

四、实验材料

(一)菌种E.coli

(二)培养基、

1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min

22×LB培养液：其它不变，水，50ml。

3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O

0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌

20 min。配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析

纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。

4无N基本液体培养基：

K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min

52N基本培养基：

K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO47H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min

6完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。

7混合氨基酸和混合维生素

五、实验步骤

(一) 诱变处理

1th day，接种：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜。

2th day，诱变：早上添加5mlLB液，继续培养5小时，取5ml菌液与离心管中，离心（3500rpm）10分钟（注意配平，相对两管相差不超过0.01g），弃上清，加生理盐水5ml，打匀沉淀，吸菌液3ml于75mm培养皿内，将培养皿置于15W 紫外灯下30cm处（处理前紫外灯预热30min），将培养皿连同盖一起置于15W 紫外灯下灭菌1min，然后打开皿盖照射1-3min，照射后先盖上皿盖再关灯。吸3ml 2倍LB液加入处理过的菌液平皿内，混匀，用黑布（纸）包好，置37℃避光培养12h以上。

(二) 营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）

3th day，延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最

后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）4th day，初筛：按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml，再放入37℃培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。缺陷型因不长避免被杀死）。5th day，从培养12、14、16、24小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。(三) 营养缺陷型检出

7th day，检出营养缺陷型。上述平板培养36－48h后，进行菌落计数。选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37℃培养。

9th day，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37℃培养24h，仍不长的是营养缺陷型。

(四) 营养缺陷型鉴定

在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况为生长谱法。

单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。如果以15种维生素进行测定，则把5种维生素归为一组，共5个组合。组别氨基酸组合组

1 赖氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸异亮氨酸

2 缬氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸

3 苏氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸

4 丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸丝氨酸

5 鸟氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺

6 胍氨酸异亮氨酸组氨酸天冬氨酸丝氨酸谷氨酰胺