可溶性蛋白质含量的测定

植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位/毫克蛋白质，unIT/Mg ProTeln)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G-250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。

方法一：LoWry法(劳里法)

【原理】

LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(F olln —酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜一蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3〜15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。

1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1〜10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。

2.福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应:

(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质一铜络合物。

(2)此络合物将试剂磷钼酸一磷钨酸(F olln试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法

高100倍，定量范围为5〜100^g蛋白质。F olln试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。

【仪器与用具】

试管若干；刻度移液管支，1MI 1支，10MI 1支；定量加样器；圆底

烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管；小烧杯；微量进样器50卩I 1支；721 分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。

【试剂】

NA2WO4 2H2O; NA2MoO4 2H2O; 85%H3PO4;浓HCI ；LI2SO4 H2O;溴水；酚酞指示剂；NA2CO3 ; NAOH ; CuSO4 5H2O;酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。

【方法】

1试剂的配制

(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4%碳酸钠(NA2CO3) 溶液与

/ L氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2% NA2CO3，

NAOH); B液：1%硫酸铜(CuSO4 5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合% CuSO4 5H2O, 0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50 : 1的比例混合即成。此为F olIn —酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。

酚试剂(相当于F olIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO4 2H2O)1OOg、钼酸钠

(NA2MoO4 2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO45OMI，浓HCI 100Ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(LI2SO4

H2O)150g，水50MI，溴水2〜3滴，不用回流装置开口煮沸15Min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000MI，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15Min)。使用时用标准NAOH 溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1MoI/L H +酸，此为F olIn —酚试剂乙液(F olIn 试剂)。

在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

(2)标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白，溶于100MI蒸馏水中,

使最终浓度为250 ^g/Ml。

2标准曲线的绘制

(1)取7 支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、

0.8ml、

1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0yg 25

50 100 yg 150 200 yg 250 卩g必要时可做重复)。

(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30°C下放置10Min。

(3)在每支试管中喷射加入(I 5M1乙液，立即振荡混匀，在30C下保温30Min。

⑷准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1CM

光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。

以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3样品的测定

(1)样品的提取：称取鲜样°旦，用5Ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。

取视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)g (3)g (4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。

(2)根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。

4结果计算

样品中蛋白的含量(Mg/g)= CXVTV1X FW 1000(2-1)

式中C:查标准曲线值(y g)

VT:提取液总体积(Ml);

F W:样品鲜重(g);

V1:测定时加样量(Ml)。

【注意】还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰

方法二：考马斯亮蓝G —250染色法

【原理】

考马斯亮蓝G —250（GooMAssle BrIIIIAnT Blue G —250）测定蛋白质含量属