进行性肌营养不良症(DMD)基因检测

第三次实验内容

进行性肌营养不良症（DMD）基因检测

一、实验目的：

掌握进行性肌营养不良症基因检测的一种简便方法。

二、实验原理：

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等特点，而多重PCR（multiplex PCR）则是用几对引物在同一个PCR反应体系中进行扩增。这样可以同时扩增出几个不同专一靶区域的片段。

进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一组原发于肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力，本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。临床表现腿的假性肥大，血清酶学明显升高。

DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，全长2.4kb左右，有79个外显子组成，编码1个3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。

抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，5％是重复突变，另35％可能是很小的DNA片段缺失或点突变。通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。

本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子（8,19,45,48），其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。

三、实验准备：

实验材料：正常对照和DMD患者外周血DNA样本。

实验器材：

实验试剂：

四、实验步骤：

1、正常对照外周血DNA样本、DMD患者外周血DNA样本分别进行PCR扩增（第二次课上已经做好）。

2、琼脂糖凝胶电泳。

①配制2%的琼脂糖凝胶

②取PCR扩增样品10μl加入3μl的6×载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

④ 140V，电泳2小时左右。

⑤卸胶，紫外仪上观察电泳条带，判断扩增产物的有无及片段大小。

五、实验结果：

正常对照样本有4条带，从负极往正极分别为外显子45、48、19和8。

DMD患者缺失不同的外显子。

六、注意事项：

1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～60%。

2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特异性好；温度低，有时会

有非特异性条带。

3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓度低，扩增产物的特异性

好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。

4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。在满足产物得率的前提下，应尽量减

少循环次数。

人类染色体核型分析

1）实验目的：

通过实验掌握染色体核型分析的常用方法以及Ｇ分带的带型特征，初步会识别Ｇ分带人类染色体。

2）实验原理：

将一个细胞内的染色体按照一定的顺序（如染色体的大小、着丝粒的位置，带型等），排列起来构成的图象就称之为该细胞的核型(Karyotype)。７０年代初出现了染色体显带技术，不仅解决了染色体识别困难的问题，而且为深入研究染色体异常及基因定位创造了条件。本次课将用Ｇ带染色体的显微相片，让同学识别不同的染色体，并进行剪贴及分析核型。

3）实验准备：

显微相片1份2张。实验器材：镊子、剪刀、胶水等。

4）实验步骤：

A、将相片上的染色体逐个剪下，按丹佛一伦敦体制排列编号。

B、粘贴时短臂向上，长臂向下。

C、写出该细胞的核型式，注明性染色体。

带型识别口诀：

一秃二蛇三蝶飘四象鞭炮五黑腰六号1、4小白脸

七上八下九苗条十号q 肩带好十一低来十二高

十三、十四、十五号（3.2.1）十六q缢痕大十七q带脚镣

十八人小大肚泡十九是黑腰二十头重脚底浅

二十一象个葫芦瓢二十二头小，身子大X扁担，两头挑

作业：

剪贴染色体显微相片一张。

人类染色体核型分析实验报告

班级------------

姓名-------------标本编号：

分析结果：

1 2 3 4 5

——————A ————————— B ———

6 7 8 9 10 11 12

————————————C —————————————

13 14 15 16 17 18 19 20

———— D —————— E —————— F —

21 22

— G —性染色体