酶活性检测

④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。

几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。

如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。

该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。

酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。

酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。

为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。

而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。

下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。

紫外-可见分光光度法测定酶活：
1. β一半乳糖苷酶
β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。

能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。

【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

2. 超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。

SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。

自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。

欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。

【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。

同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD 活性进行校正。

【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位，即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。

3. 多酚氧化酶
多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。

大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。

大
麦中部分PPO以“潜伏”状态存在，在浸麦过程中，可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。

在大麦发芽过程中，PPO的活力较高，影响着麦芽的质量。

因此，在制麦过程中应该降低PPO活性。

【酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚(用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制)80oC反应3min，用2mL 20%TCA终止反应，于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。

【酶活定义】上述条件下，将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。

4. 葡萄糖氧化酶
上世纪60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业，除去葡萄糖，防止发生Maillard反应，稳定产品质量，延长保质期。

80年代末，又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。

【酶活测定】采用-联(二)茴香胺分光光度法。

在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体即邻一联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。

于436nm处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。

【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26℃下每分催化释放一微克分子H2O2所需的酶量。

5. 果胶酶
果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，对提高红葡萄酒的品质有重要作用。

【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用0.05 mol/L
Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节pH 10.0)，于55℃水浴下保温5 min，然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min，加入DNS试剂1.5 mL，混匀，在沸水中加热10min，立即用自来水冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm测定吸光度。

空白用煮沸失活的酶液代替。

【酶活定义】在上述试验条件下，以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位。

6. 胰α-淀粉酶
【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管，并在水浴中调温至25℃。

加0.5 mL 已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。

3 min后加1.0 mL DNS显色剂。

置试管于沸水中5 min，冷却后用10 mL蒸馏水稀释。

用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。

以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。

7. 植酸酶
【酶活测定】以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。

吸取1 mmol/l
的植酸钠(酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制)1.0 ml，37 oC 预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml(对照组先加反应终止液)，37 oC水浴反应
30min后，再加入4 ml反应终止液(现用现配)冷却至室温，在415 nm处测定OD值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。

【酶活定义】在37℃，每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中(用pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。

8. 羧甲基纤维素酶
【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液，于50℃水浴中保温30min，加2.0 mL质量分数为10%的NaOH溶液终止反应，再加入2.5mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸15min，冷却，在550 nm波长处比色，要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。

每次测定均设立空白对照，对照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL质量分数为10%的NaOH溶液将酶灭活，再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL，与待测管一起保温，加入DNS，煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。

【酶活定义】在上述条件下，每30min产生0.5mg还原糖为1个Cx活力单位，即每1 h产生1.0mg还原糖为1个Cx活力单位。

9. 木聚糖酶
木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖)，使其成为水溶性的，水解率达65%。

面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水性和机械强度，使面团具有更好的持气能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的品质。

【酶活测定】以木聚糖为底物，用DNS法测定还原糖的生成量。

取稀释酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保温30min后，加DNS 2ml于沸水浴中显色3min，用自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。

【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。

10. 蛋白酶
【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。

通过在660 nm测定其吸光度,可得到酶解产生的酚基氨基酸的量,计算出蛋白酶活力,以此代表蛋白酶的总酶活力。

【酶活测定】取3支试管(一支空白管,两支样品管),分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL,将3支试管放入40℃水浴中预热5 min,同时将测定底物(1%酪素)置同一温度水浴中预热5 min。

分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,准确计时,反应10 min取出。

迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三氯乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L 三氯乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液,摇匀。

3支试管中反应液用滤纸过滤。

另取3支试管,分别吸取上述相应滤出液1.0 mL,0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL,摇匀,置40℃水浴中放置20 min(显色),取出,迅速冷却置室温。

以空白管调仪器零点,在分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度,取平均值。

通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。

11. α-淀粉酶
α-淀粉酶是第一个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶含量不稳定而且含有蛋白水解酶。

【酶活测定】在10 mL 试管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL , pH 4. 2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 5 mL, 40 ℃预热10 min。

然后加入多倍稀释的0. 5 mL 酶液, 40 ℃保温5 min后,加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 终止反应。

再取2 mL 反应液与0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL显色,测定OD620。

与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后,计算酶活力。

【酶活定义】在pH 4. 2、温度40 ℃下, 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量为一个酶活力单位。

12. 脂肪酶
利用脂肪酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，作调料剂;用有专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种，制备代可可酯等高档油脂;另外，脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包质量、改善蛋白的发泡等方面。

【酶活定义】在40℃、pH 7.5，以每分钟从橄榄油中释放lμm ol脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位。

13. 漆酶
【酶活测定】3.0mL反应液中含20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液0.lmL和25 mmol/L
琥珀酸缓冲液(pH4.5)，在25℃下反应2min后立即用冰浴终止反应，测定436nm处吸光度的增量。

14. 木质素过氧化物酶
【酶活测定】30℃条件下反应体系中含酶液，浓度为0.2mol/L，且pH值为2.4的酒石酸缓冲液及浓度为0.008mol/L的黎芦醇各lmL，加人浓度为0.016mol/L的H2O2 lmL 启动反应，测定反应最初4min内在310nm处的吸光度，以灭过酶活的酶液作对照。

15. 锰过氧化物酶
【酶活测定】室温下反应体系中含有50mmol/L pH4.5的乳酸钠缓冲液3.4mL，
1.6mmol/L的MnSO4溶液0.lrnL，酶液0.4rnL，加人1.6 mmol/L的H2O2 0.lmL启动反应。

测定反应最初4min内在240nm处的吸光度。

【酶活定义】每分钟使1μmol的Mn2+转化成Mn3+所需要的酶量为一个酶活单位。

仪器配置
Thermo公司Genesys系列、Helios系列和Evolution系列紫外-可见分光光度计均可进行食品酶分析。

EnzLab软件是Thermo公司研制的专业食品酶分析软件，具有智能提示功能，可以一步步引导操作员完成酶活测定。

即使不是酶分析专家，也能获得准确、可靠的数据。

而且该软件支持手动输入模式，即使实验室使用的是其它品牌的分光光度计，也能享受EnzLab软件带来的智能和便捷
酶活性的测定方法
动物实验中常见的一些需要测定的酶包括丙氨酸氨基转氨酶、天冬氨酸氨基转栘酶、乳酸脱氢酶、肌酸脱氢酶、7γ-谷氨酰转肽酶等。

（一）丙氨酸氨基转氨酶的测定：丙氨酸氨基转移酶（ALT），即谷丙转氨酶(GTP)，主要分布于肝脏、心肌，骨骼肌及其他组织中含量轻低。

ALT的测定有酶联-紫外连续监测法和比色法。

酶联-紫外连续监测法首先由ALT催化丙酮酸与α—酮戊二酸反应，生成丙酮酸与谷氨酸，第二步以乳酸脱氢酶（LD）为指示酶催化丙酮酸与NADH反应，产生乳酸与NAD ＋，由于反应平衡点偏向乳酸及NAD＋的生成，因此可在340nm连续监测NADH被氧化的速度。

根据单位时间内NADH的减少量及摩尔吸光系数计算ALT活性。

比色法首先亦为ALT使丙酮酸与α—酮戊二酸反应，生成丙酮酸与谷氨酸，继而使丙酮酸与2，4－二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯肼，其在碱性溶液中显棕红色。

根据色泽深浅计算出丙酮酸含量，再换算转氨酶的活性单位。

（二）天冬氨酸氨基转移酶的测定：天冬氨酸氨基转移酶(AST)，即谷草转氨酶(GOT)，分布于心肝及骨骼肌的胞浆与线粒体中。

测定方法也包括酶联-紫外连续监测法和比色法。

酶联-紫外连续监测法首先由AST催化天冬氨酸与α－酮戊二酸反应生成草酰乙酸与谷氨酸，第二步以苹果酸脱氢酶为指示酶催化草酰乙酸与NADH反应，使草酰乙酸生成苹果酸，而NADH氧化成NAD＋，反应平衡点偏向草酰乙酸的消耗与NAD＋的产生。

因此可用类似ALT的连续监测法计算AST活性。

比色法是通过AST作用于天冬氨酸与α－酮戊二酸产生草酰乙酸与谷氨酸，草酰乙酸在体系中自行脱羧或加入柠檬酸苯胺脱羧生成丙酮酸。

在酶促反应达到规定时间后，加入2 ，4－二硝基苯肼终止酶反应，用ALT同样的比色法测定AST 的活性。

（三）乳酸脱氢酶的测定
1．乳酸脱氢酶的测定：乳酸脱氢酶（LD）的测定可利用以乳酸为底物的顺向反应，或利用以丙酮酸为底物的逆向反应，顺、逆向反应均可应用比色法及分光光度法测定酶活性。

比色法的原理是利用产物丙酮酸与2 ,4－二硝基苯肼作用生成丙酮酸、二硝基苯肼，后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液中呈红棕色。

颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，与标准浓度丙酮酸生成的苯肼进行比色，可推算LD活性。

分光光度法是利用顺向反应或者逆向反应，在340nm连续监测NADH的生成速度或消失速度，再根据NADH的吸光系数即可计算出LD 的活性单位。

比色法中以丙酮酸与2,4－二硝基苯肼反应为最常应用，但只能利用其顺向反应。

分光光度法优点较多：顺向反应中以NAD＋、乳酸为底物都比较稳定，过量乳酸对LD 的抑制作用小于过量丙酮酸；逆向反应NADH的用量只有正向反应NAD+的3%，酶促反应速率快于正向反应，所以应用样品量少且可在短时间内完成测定。

2．乳酸脱氢酶同工酶的测定：LD是由H亚基和M业基组成的四聚体。

从LD同工酶的组织分布来看，LD同工酶的测定具有—定的器官组织特异性。

目前主要检测方法有电泳法、层析法、免疫化学法、热稳定法和抑制剂法。

电泳法是利用LD同工酶肽链结构不同及等电点的差异，以醋酸纤维薄膜、淀粉胶、聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶做支持介质，在电场中使各种LD同工酶得以分离。

由于醋酸纤维薄膜电泳方法简便、快速，使用最为普遍。

（四）肌酸脱氢酶的测定肌酸脱氢酶（CK）测定有比色法和酶偶联-紫外连续监测法两种。

比色法包括无机磷酸法、酶偶联-丙酮酸测定法和肌酸显色法。

无机磷酸法是利用正向产物磷酸肌酸在酸性溶液中释放无机磷，用钼酸铵与无机磷反应生成磷钼酸，再使用氨基萘磺酸使磷钼酸还原成钼蓝，之后进行比色测定计算磷酸量的多少推算CK活性。

酶偶联-丙酮酸测定法是利用CK催化的正向产物ADP可与磷酸烯醇式丙酮酸作用，在工具酶丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸和ATP，再用2，4-二硝基苯肼与丙酮酸反应。

利用生成的丙酮酸苯肼推算CK活性。

肌酸显色法是利用逆向反应产物测定CK活性的一种方法，即肌酸与双乙酰
及α－萘酚结合生成红色化合物，在一定范围内红色深浅与肌酸含量成正比。

酶偶联-紫外连续监测法是利用逆反应产物A TP与葡萄糖在已糖激酶催化下产生6-磷酸葡萄糖．再偶联6-磷酸葡萄糖脱氢酶使体系产生NADPH，通过340nm测定NADPH的生成速度计算CK活性。

比色法中的无机磷酸法、肌酸显色法是比较常用的方法。

前者底物和试剂易得，反应过程稳定；后者反应速度较快，灵敏度高，不受血中无机磷的干扰。

酶偶联-紫外连续监测法是国际上最常用的方法。

（五）7γ-谷氨酰转肽酶测定谷氨酰转肽酶(7γ－GTP)，又称γ－谷氨酰转移酶（γ－GT），γ-GT 在机体中分布比较广泛，如肝、胆、胰、小肠等组织的细胞膜上，参与氨基酸向细胞内的转运，在许多疾病时γ-GT可表现升高。

γ-GT活性测定主要有比色法及连续监测法。

γ－萘胺比色法是利用γ-L-谷氨酰-γ-萘胺作为γ-谷氨酰的供体，以双甘肽为受体，在γ-GT催化下，产生γ-萘胺与重氮试剂(重氮苯磺酸)反应，生成红色的γ-萘胺-对-偶氮笨磺酸，其色泽深浅与酶活性成正比。

本法要求37℃保温15分钟即可进行比色测定。

对-硝基苯胺连续监测法是以γ-L-谷氨酰-对-硝基苯胺为γ-谷氨酰基的供体，双甘肽为受体，在γ-GT催化下生成γ-谷氨酰双甘肽与对-硝基苯胺。

在碱性pH条件下对-硝基苯胺呈现黄色，可用405nm波长连续监测对-硝基苯胺的形成速率。

根据单位时间内吸光度的增加及对-硝基苯胺的摩尔吸收系数（＝9870），推算Y—GT活性。

γ-萘胺比色法不需要去除蛋白质，操作简便．线性关系好．颜色稳定，但底物水溶性较差。

对－硝基苯胺连续监测法简便快速、灵敏，重复性好，自动生化分析仪测定已采用其原理与程序。

但本法底物溶解性较差且要求临用前配制。

测定时可做一不加酶的对照，消除底物因不稳定引起的自动水解。

（六）磷酸酶的测定
1．碱性磷酸酶测定：碱性磷酸酶(ALP)是一组在碱性条件下具有较强活性的酶类。

该酶对底物的专一性较差。

因此，实验所用底物种类较多，如α－甘油磷酸、磷酸对硝基酚、磷酸苯二钠、磷酸酚酞等。

ALP催化上述底物并使其产生无机磷酸和羟基化合物。

测定ALP的方法主要有两种：一是测定底物解离下来的游离磷酸根来计算酶活性；二是测定产物羟基化合物计算酶活性。

常用方法有α—甘油磷酸法、磷酸苯二钠法、磷酸对硝基酚法三种。

磷酸对硝基酚法操作步骤较多，已不采用。

磷酸苯二钠法反应速度快，灵敏厦高，不需去蛋白，又因血中很少有酚及酚类化合物，故用试剂空白代替标本空白即可。

磷酸对硝基酚法中的酶促反应所需时间短，结果准确。

ALP的最适pH随着各种条件的改变而有所不同，缓冲液的组成是影响活性的主要原因。

血清ALP受热会迅速变性，Mn2＋为ALP活性剂，而Zn2＋、磷酸盐等均有抑制作用。

2．酸性磷酸酶：酸性磷酸酶（ACP）也是一组对底物专一性较差的酶类。

在pH5的环境中可水解各种磷酸酯。

ACP催化的底物和反应原理基本上与ALP相似，因此也有甘油磷酸法，磷酸苯二钠法，磷酸对硝基酚法等。

但ACP不稳定，在37oC，Ph> 7.0条件下活性丧失较快。

因此，应将其保存在酸性环境中并置于冰箱内存放。

红细胞含有大量ACP，故溶血标本不能用于ACP测定。