皮卡佐剂及其治疗性疫苗作用机理
Open Journal of Nature Science 自然科学, 2015, 3(3), 70-80
Published Online August 2015 in Hans. https://www.360docs.net/doc/866692883.html,/journal/ojns
https://www.360docs.net/doc/866692883.html,/10.12677/ojns.2015.33010
Mechanisem of Action of PICKCa Adjuvant
and Its Therapeutic Vaccines
Haixiang Lin*, Yi Zhang
Beijing Yishengxingye Science and Technology Co. Ltd., Beijing
Email: *haixianglin510@https://www.360docs.net/doc/866692883.html,
Received: Jul. 27th, 2015; accepted: Aug. 14th, 2015; published Aug. 21st, 2015
Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
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Abstract
PICKCa, a safe vaccine adjuvant for human use, is a complex of poly IC-kanamycin-Cacl2. It is the li-gand of pattern recognition receptors of TLR3, NOD and RIG-1. PICKCa vaccines can activate innate pathways in vivo to produce cytokines including IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-12p40, IL-6, TNF-α, promote macrophage function, stimulate antigen-presenting cells to produce co-stimulators of CD40, CD80, CD86, activate cell-mediated immunity and humoral immunity. Due to PICKCa adjuvant en-hancing productions of IFN, IL-2, IL-12, the adjuvant may make prophylactic vaccines from main humoral immunity to possess strong cell-mediated immunity as therapeutic vaccines. In 3 indepen-dent assays of post-explosure immunizations of mice and beagle dogs, PICKCa rabies vaccine was much better than commercial adjuvant-free rabies vaccines, the protective rate was 70% - 100% and 20% - 30% respectively, and the statistical analyses were significantly different (P < 0.05 - 0.01).
PICKCa rabies vaccine and PICKCa hepatitis B vaccine are ongoing in phase-1 clinical trials in Singa-pore.
Keywords
PICKCa Adjuvant, Therapeutic Vaccines, Mechanisem of Action
皮卡佐剂及其治疗性疫苗作用机理
林海祥*，张译
北京依生兴业科技有限公司，北京
Email: *haixianglin510@https://www.360docs.net/doc/866692883.html,
*通讯作者。
林海祥，张译收稿日期：2015年7月27日；录用日期：2015年8月14日；发布日期：2015年8月21日
摘要
皮卡是人用安全的疫苗佐剂，是双链聚肌苷酸聚胞苷酸及微量卡那霉素和氯化钙的复合物。该佐剂是三种模式识别受体TLR3、NOD和RIG-1的配体。皮卡佐剂疫苗与受体结合后在体内活化非特异免疫，包括巨噬细胞吞噬功能，促进干扰素(IFN)、白细胞介素-2(IL-2)、-6、-12、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的产生，促进产生共刺激因子CD40、CD80、CD86，促进抗原呈递细胞的提呈、活化T淋巴细胞，促进特异性的细胞免疫和体液免疫应答，促进免疫细胞的增殖。皮卡佐剂不仅提高疫苗的免疫原性，更由于促进干扰素、白细胞介素-2、-12的产生，使从主要产生体液免疫的预防性疫苗转变成具有强烈细胞免疫的治疗性疫苗。在三次独立的先感染后免疫的暴露后小白鼠和比格犬的试验中，在没有接种抗血清情况下，国内外市售人用狂犬病疫苗保护率仅为20%~30%，而皮卡狂犬病疫苗可高达70%~100%，统计学分析具有显著的差异(P < 0.05~0.01)。皮卡狂犬病治疗性疫苗和皮卡乙肝治疗性疫苗正在新加坡进行1期临床研究。
关键词
皮卡佐剂，治疗性疫苗，作用机理
1. 引言
治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染的治疗，在抗肿瘤和抗感染的免疫反应中，细胞免疫的激活是至关重要的因素。选用适合的佐剂以增强免疫原性，并使免疫应答偏向细胞免疫(此即免疫反应类型的转换)是治疗性疫苗能否成功的重要途径。我们经过30年的研究包括其他国内外机构在狂犬病疫苗[1]、乙肝疫苗[2]、结核菌苗(待发表资料)、流感疫苗[3]-[5]等独立研究结果显示皮卡佐剂疫苗显著地促进了非特异性和特异性免疫，特别是细胞免疫，与预防性疫苗不同，是具有治疗作用的疫苗。如表1所示皮卡狂犬病疫苗更具有治疗性疫苗特性。
人体抗感染免疫首先是非特异性免疫停止感染的发生和继续，随后是特异性免疫清除或治愈感染。Bruce, A.B.和Hoffmann, J.A.发现TLRs膜式识别受体可以与微生物基本成分结合活化非特异免疫[6] [7]，Steinman, R.M.发现树突状细胞活化T淋巴细胞启动特异性免疫[8]而共享2011年诺贝尔生理学和医学奖。这些发现明确了皮卡佐剂及其疫苗成为治疗性疫苗的机理。
皮卡佐剂是三类膜式识别受体(pattern recognition receptor PRR)的配体[9] [10] [23]，如图1[11]所示，第一类是Toll-受体系统(Toll-like receptors, TLRs)中的TLR3，可直接识别dsRNA或其类似物皮卡，这是先天性免疫的受体，识别后激活B细胞的核内因子(nuclear factor k of activated B cell, NF-κB)，促进炎症因子和1型干扰素(IFN1)表达。第二类是核苷酸结合寡核苷酸域(nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白家族，是先天性免疫系统另一类重要受体，其羧基端为皮卡配体结合域，氨基端是信号传递位点，也可以激活NF-κB。第三类是RNA螺旋酶。视黄酸诱导基因I (retinoic acid inducible gene I, RIG-I)，RIG-I能够识别病毒dsRNA组分，活化NF-κB，激活干扰素调节因子3 (interferon regulatory factors 3, IRF-3)，启动免疫和炎性基因，释放炎性因子和1型干扰素[9] [12]。由大部分病毒繁殖过程中产生的dsRNA和其类似物皮卡与这些PRRs结合后启动依赖和非依赖髓样分化88 (myeloid differentiation88, My88)信号传导或者通过含有诱生干扰素β接头蛋白的Toll样白细胞介素1受体域(Toll IL-1 receotor domain containing adaptor-inducing interferon β, TRIF)路径，快速引起NF-κB产生，促进分泌细胞因子，再通过抗原提呈细
林海祥，张译
Table https://www.360docs.net/doc/866692883.html,parison of PICKCa with rabies therapeutic vaccine and prophylactic
表1.皮卡狂犬病疫苗与治疗性和预防性疫苗的异同
组别治疗性疫苗预防性疫苗皮卡狂犬病疫苗
使用对象已病或已感染者未病或未感染者暴露后即已感染者
使用目的治疗或阻断疾病预防疾病阻断狂犬病
受用者状态患者健康人暴露后患者
监测手段综合测试保护性抗体细胞因子保护性抗体
免疫应答类型细胞免疫为主体液免疫细胞免疫体液免疫
Figure 1. Participated PRR and its ligands in a host infected viruses
图1. 机体识别病毒感染过程中参与的模式识别受体及其配体
胞(antigen present cells, APC)活化T细胞，产生类炎性因子和IFN1。IFN诱导的dsRNA激活的蛋白激酶R (protein kinase regulated by double-stranded RNA, PKR)是dsRNA的细胞内受体，识别dsRNA后，PKR 聚合且自动磷酸化。PKR的底物主要是真核细胞启动因子2α，故PKR能抑制mRNA翻译成蛋白而减弱受染细胞病毒蛋白的合成，及至抑制病毒复制。如图1所示，dsRNA类似物皮卡佐剂的优点是可以被多种受体识别，促进抗原交叉提呈，通过信号传导通路，促进细胞毒T细胞的增殖[13] [14]，交叉提呈还可以促进IFN1产生[15] [24]，调节随后的特异性免疫反应，增强机体抗击病毒的能力，发挥很强的佐剂效果，是优秀的疫苗佐剂[16]。
下列各项国内外实验结果验证了皮卡佐剂及其疫苗显著促进机体免疫的各个过程，特别是细胞免疫，明确了其具有治疗作用的机理。
2. 皮卡是多种PRRs的配体
图2这一组试验结果是皮卡佐剂在TLR3基因缺失与不缺失小鼠中的抗流感病毒反应[4]。图2(a)是用一种质粒表达系统(A plasmid expression system)测定出皮卡不仅可以被TLR3识别也可以被黑色瘤分化相关基因5 (MDA5)及RIG-1识别，MDA5是胞浆内核酸受体，识别ds RNA，与RIG-1相似，激活NF-κB，
林海祥，张译
促进IFN1产生。图2(b)是对TLR3基因缺失和不缺失小鼠鼻内滴注皮卡佐剂或PBS，100微克/只，24 小时后取肺匀浆，采用试剂盒ELISA方法测定和分析各种细胞因子，结果表明与对照组比较，皮卡能显著地上调细胞因子表达水平。图2(c)和图2(d)是先鼻腔感染50TCID50 H7N1流感病毒然后再用皮卡治疗，结果表明皮卡佐剂对TLR3基因缺失与不缺失小鼠与只给PBS对照组小白鼠比较在鼻腔(图2(c))和肺(图2(d))都能显著抑制病毒的繁殖(P < 0.05)。
3. 皮卡和皮卡疫苗活化巨噬细胞功能[1]
皮卡佐剂和皮卡狂犬病疫苗被PRRs识别后活化了巨噬细胞吞噬抗原等一系列功能。活化的单核巨噬细胞能够非特异防御，吞噬各种抗原，在不产生免疫反应情况下将抗原降解以达清除的目的；将加工后的抗原提呈给T细胞，当CD4+辅助T细胞识别巨噬细胞表面的抗原时，生成的γ干扰素又进一步激活巨噬细胞，上调MHCII类分子的表达，有效地杀伤病原体；同时分泌IFN、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6、IL-12，这是使机体在抗病毒感染中转向细胞免疫的原始动力[17]。表2结果表明皮卡佐剂和皮卡狂犬病疫苗与单纯疫苗和生理盐水比较能显著促进巨噬细胞的功能。
4. 皮卡疫苗促进干扰素的分泌[1]
I型干扰素主要由IFN-α，IFN-β组成，由单核巨噬细胞产生；II型IFN-γ只能由NK细胞、激活的T 淋巴细胞产生。I型与II型IFN都具有抗病毒作用，是有效抵抗病毒入侵的多功能细胞因子。表3结果表明市售疫苗不能产生干扰素，只有皮卡疫苗能在疫苗注射后几个小时就能产生非特异性干扰素，证明
(a) (b) (c) (d)
(a) 用质粒表达系统测定皮卡佐剂对多种PRRs的识别；(b) 皮卡对TLR3基因缺失和不缺失小鼠产生细胞因子的影响。TNFα，IFNγ，MIP-1b (巨噬细胞炎性蛋白1b)，MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)，Rantes (趋化因子)，KC (肝巨噬细胞)，IFN-β；(c) (d) 皮卡佐剂对TLR3基因缺失与不缺失小鼠在鼻腔(NT)和肺(Lungs)对流感病毒繁殖的影响
Figure 2. The anti-influ responses stimulated by PICKCa in mice of dispensableTLR3-gene
图2. 在TLR3基因缺失与不缺失小鼠中皮卡佐剂的抗流感病毒反应
Table 2.Phagocytic function of macrophages of mice immunized with rabies vaccine using PICKCa adjuvant [percentage of phagocytosis, (phagocytosis index)]
表2.巨噬细胞吞噬功能(吞噬百分数和吞噬指数)测定*
组别0天3天7天14天
皮卡66% (1.93) 58% (0.98) 78% (2.74) 48% (0.99)
皮卡疫苗82% (1.48) 70% (1.9) 66% (2.46) 45% (1.14)
疫苗4% (0.09) 10% (0.12) 27% (0.45) 12% (0.14)
生理盐水11% (0.13) 31% (0.47) 34% (0.49) 6% (0.12)
*0天组免疫一次，3天组免疫二次，7天组免疫三次，14天组免疫四次。检测时，于免疫后2小时注射鸡红血球，4小时后取腹腔巨噬细胞检测。吞噬百分数：吞噬了红血球的巨噬细胞百分数。吞噬指数(括号内数字)：每个巨噬细胞吞噬红血球个数的平均数。
林海祥，张译
皮卡佐剂激活巨噬细胞和NK细胞，早期启动和活化机体非特异性免疫，产生向细胞免疫方向发展的细胞因子，在决定免疫方向上发挥了关键作用[18]。TLR3识别dsRNA或皮卡疫苗后能诱导很强IFN1的产生和共刺激分子的表达有助于建立局部的抗病毒状态，限制病毒在感染部位的复制，结合上述促进巨噬细胞功能，这在3度咬伤狂犬病防治中有类似于被动抗体的作用。
5. 皮卡(PIKA?)佐剂激活机体树突状细胞(dendritic cells, DC)上调共刺激分子
初始T细胞的活化需要两个信号共同刺激，第一信号来自抗原,提供方式是抗原-MHC与T细胞受体的相互作用和结合，该信号确保免疫应答的特异性；第二信号是共刺激分子信号，是存在APC表面，能与Th细胞共刺激分子受体结合，以确保免疫应答在需要的时候发生，其中最具特征的是CD80和CD86，CD40。图3是用皮卡佐剂与小白鼠骨髓分化的树突状细胞(BMDCs)作用后平均荧光强度(Mean Fluores-cence Intensity MFI) CD80从59.82%~90.66%、CD86从11.70%~38.66%、CD40从16.98%~58.62% [2]，显著地上调共刺激分子产生。
6. PIKA?佐剂体内诱导产生细胞因子
(1) 激活Th细胞，提高IL-2的滴度[1]
用PBS、2.75 μg灭活纯化狂犬病疫苗(IPRV)和2.75 μg IPRV与75 μg皮卡复合，皮下免疫C3H小鼠，Table 3.IFN level induced in immunized mice with various rabies vccines
表3.皮卡佐剂疫苗和单纯疫苗对小白鼠干扰素的诱导
0天3天7天
PBS <20 / / 市售铝佐剂疫苗<20 / /
纯化苗<20 / <20
皮卡苗254.6 269.2 239.2 0天注射疫苗1次，3天注射第2次，7天组注射第3次，每次注射后两小时取血用细胞病变法(CPE)测定干扰素。
方法：C57BL/6小鼠BMDC细胞体外与PIKA共同孵育18小时。FACS检
测CD80+，CD86+和CD40+细胞的平均荧光强度。
Figure 3. Up-regulation of co-stimulatory molecules of dendritic cells
activated by PICKCa adjuvant
图3. PIKA?佐剂激活机体DC上调共刺激分子产生
林海祥，张译
一周后取出脾细胞，并用培养液和不同剂量的IPRV 于体外刺激，24小时后收获上清液掺入3H 胸腺嘧啶同位素，6小时后，将细胞收集在纤维滤纸膜上，80℃烘干，在计数仪上测定CMP 数。
从表4可以看到皮卡IPRV 组IL-2的产量显著高于单纯IPRV 组及PBS 组，说明皮卡与IPRV 复合后能够在体内刺激T 淋巴细胞增强细胞免疫。T 细胞活化引起细胞分裂(大量增殖，达到整体功能所需的数量水平)和分化(使T 细胞具有分泌细胞因子或细胞杀伤的功能)。淋巴因子的分泌是T 细胞活化的主要表现形式。不同的抗原刺激可使初始T 细胞分泌不同种类的细胞因子，从而产生不同的效应，而IL-2是初始Th1细胞产生的最重要的细胞因子。
(2) 皮卡佐剂促进细胞因子的产生
每只小鼠500微克PIKA 佐剂经腹腔注射，不同时间取血分离血清，用相应特异ELISA 方法检测IFN-γ、IL-12p40、IL-6、TNF-α等细胞因子的产生。表明PIKA 佐剂可诱导细胞因子IFN-γ、IL-12p40、IL-6、TNF-α的产生，但产生的时间点不同，其中TNF-α到达高峰时间为1小时，IL-12p40、IL-6为2小时，IFN-γ为5小时，见图4 [2]。
Table 4. IL-2 production of C3H Mice immunized with IPRV or PIKA-IPRV
表4. 用IPRV 或皮卡IPRV 免疫C3H 小鼠诱生IL-2的测定 Group
IL-2 Production (CPM 10?3) IPRV (μg) Medium 0.026 0.132
0.66 3.3 16.5 PBS
0.4 0.5 0.6 0.55 - - IPRV
3.4 5.4 16.8 33.8 33.6 33.4 PIKA-IPRV
29.5 29.5 47.4 53.9 53.7 52.7 IL-2
Reference
product Dilution and CPM 10?3 0 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 74.4 77.3 66.6 39.5
18.3 8.8 4.0 CTLL control
CPM 10?3
0.4
Balb/C mice administered intra-peritoneal injection of PICKCa 0.5 mg followed by the
collection of blood samples at 0, 1, 2 and 5 hours. Blood serum then tested by ELISA for
the detection of cytokines.
Figure 4. Cytokines levels enhanced by PICKCa adjuvant in vivo
图4. 皮卡佐剂促进体内细胞因子的产生
林海祥，张译
Th1类细胞因子主要包括IL-2、IL-12、IFN、TNF等，由NK和T细胞产生的IFN-γ以及巨噬细胞产生的IFNα IL-12p40。皮卡佐剂促进产生内源性IFN、IL-12使T0向Th1细胞免疫转化。Th2类细胞因子主要包括IL-4 、IL-5、IL-6、IL-10。上述结果表明皮卡佐剂狂犬病疫苗既有促进Th1类细胞因子产生又有促进Th2类细胞因子产生，既促进了细胞免疫又促进了体液免疫。
7. 皮卡疫苗对体液免疫的促进作用[1]
(1) 降低ED50抗原量的比较
用一批灭活纯化狂犬病疫苗(IPRV)分别加不同剂量的皮卡和铝佐剂按照NIH狂犬病疫苗效力测定方法，于0，7天免疫，第14天用狂犬病攻击毒株(CVS)病毒脑内攻击，观察死亡率，计算ED50。
表5结果显示皮卡IPRV与未加皮卡的IPRV相比减少ED50抗原量5~10倍，而铝佐剂IPRV仅减少1倍左右，见表5。
(2) 提高IgG和中和抗体效价[1]
用IPRV、皮卡IPRV和Al2O3 IPRV皮下免疫OF1小白鼠(注射量IPRV 1.67 μg/只，皮卡75 μg/只，Al2O3 75 μg/只)，按0、3、7、14、30天免疫5次，其间不同天数从小白鼠眼眶静脉采血，分离血清，灭活后用ELISA方法检测IgG抗体，用RFFIT方法检测中和抗体。
结果表明皮卡IPRV能明显促进小白鼠狂犬病抗体的提高，具有抗体产生早，滴度高，维持时间长的特点，而铝佐剂IPRV在免疫后4天和7天的早期抗体水平反而下降，14天后才有所升高，见图5。
Table 5.Stimulated effects of PIKA and aluminium adjuvant to inactived and purified rabies vaccine (IPRV) with NIH test 表5.用NIH方法比较皮卡佐剂和铝佐剂对IPRV效价的促进作用
Group Quantity (μg) Injected PICKCa ED50
0 Day 7 Day (ng)
IPRV 0 0 221 PICKCa—IPRV 100 100 22 PICKCa—IPRV 800 800 40 Al2O3-IPRV3000 3000 93 Al2O3-IPRV1000 1000 132
Figure 5. Neutralizing antibody levels of mice immunized with various rabies
vaccines
图5. 皮卡狂犬病疫苗、铝佐剂疫苗与单纯疫苗产生中和抗体产生的比较
林海祥，张译
上述两项试验表明皮卡佐剂提高了疫苗的免疫原性，促进了体液免疫。
8. 皮卡佐剂刺激脾细胞及其B细胞、NK细胞的活化增殖及免疫记忆
(1) 增殖B细胞和NK细胞[2]
通过细胞亚群分析，PIKA佐剂在体内外直接诱导细胞因子的产生，促进B细胞和NK细胞的活化和增殖，见图6。取小白鼠脾细胞与皮卡250微克/毫升一起37℃孵育3天，收获细胞洗后与相应抗体粘附，以CD25为标志物，通过流式细胞仪测定其活性和百分数，与对照组比较使CD19 B细胞从3.25~25.46，Ly49 NK细胞从5.40~37.40，均显著增殖了B细胞和NK细胞。NK细胞是机体非特异免疫细胞，能直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，能合成和分泌IFN-、TNF等多种细胞因子，B细胞增殖提高体液免疫水平。位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线并且是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[11]。
(2) 促进免疫淋巴细胞(脾细胞)的增殖[19]
在检测皮卡IPRV对IL-2的促进作用时，于显微镜下还观察到对脾细胞具有明显的增殖作用。我们用3H胸腺嘧啶掺入法测量这种现象，表6结果表明皮卡疫苗可显著地促进淋巴细胞增殖。
9. 皮卡佐剂狂犬病疫苗促进人体免疫记忆细胞产生IFN-γ
图7结果为对志愿人体免疫皮卡狂犬病疫苗2.5年后，取外周血分离单核细胞，用狂犬病抗原体外Table 6.Proliferation of splenocytes from mice immunized with IPRV or PIKA-IPRV and stimulated in Vera with IPRV or PIKA
表6.皮卡IPRV或IPRV免疫小鼠和体外刺激后对脾细胞增殖作用的比较
Group
Proliferation (CPM 10?3) of splenocytes after stimulation with Medium IPRV PIKA
IPRV 0.264 0.192 0.532 PIKA-IPRV 3.216 2.413 3.667 PBS 0.675 0.433 2.699
Figure 6. Generation of B and NK cells stimulated by PICKC adjuvant
图6. 皮卡佐剂促进B细胞和NK细胞增殖
林海祥，张译
Figure 7. IFN-γSPF in PBMCs of volunteers immunized with rabies vaccine
图7. 皮卡佐剂狂犬病疫苗促进人体免疫记忆细胞产生IFN-γ SPF数量
刺激，以ELISPOT方法检测，结果可见到具有细胞免疫的IFN-γ显著增加(待发表资料)。
机体完整的抗感染免疫反应是随着抗原的清除，大多数活化T细胞死于细胞凋亡，以维持自身稳定的基础状态，少数T细胞分化为长寿命的记忆细胞，在再次抗原刺激时发挥快速的免疫应答作用。检测表明皮卡疫苗不仅激发试验动物也能激发对人体的免疫促进作用，也符合上述作用机理，这是很有意义的结果。
图7结果可见到皮卡狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年后用ELISPOT方法检测外周血单核细胞IFN-γ，与未注射狂犬病疫苗正常人比较经相应抗原刺激后IFN-γ显著增加。表明皮卡狂犬病疫苗对人体也有很好的免疫记忆反应。
上述试验结果表明皮卡佐剂疫苗被多种膜式受体识别后，显著地促进了机体的非特异和特异性免疫反应。皮卡佐剂疫苗是如何转变免疫类型促进由主要起预防作用的体液免疫向细胞免疫转换而具有治疗作用呢？机体的T淋巴细胞分为Th0、Th1、Th2。皮卡疫苗与膜式识别受体结合后，活化巨噬细胞产生后产生IFN-α，IL-2、IL-12，活化NK细胞产生IFNｒ，而使T细胞向Th0、Th1分化，这是皮卡疫苗使单纯疫苗从主要诱生体液免疫向细胞免疫转化具有治疗作用的主要原因[18]。TH1介导细胞免疫，特别有利于清除细胞内感染，如表1所示这也是成为治疗性疫苗和预防性疫苗最主要的区别。临床上可以观察到肿瘤患者中IFN和IL-2减少，IL-10上升，表明肿瘤在生长，有Th1向Th2转化倾向。
DC联接外周和淋巴组织也是联接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。当PPRs和dsRNA发生作用，使DC成熟。成熟的DC表达MHC和共刺激分子CD40、CD80等，到淋巴结后，活化的DC产生细胞因子并活化初始T淋巴细胞，产生以细胞免疫为主的特异性免疫反应[20]。
在法国巴斯德研究所、武汉生研所和军科院兽研所应用小白鼠和Beagle犬三次暴露后实验即先皮下或肌肉感染狂犬病野毒株病毒，然后再用狂犬病疫苗免疫，结果均显示皮卡狂犬病疫苗具有极其良好的保护效果，即在没有联合应用抗血清情况下，国内外市售人用狂犬病疫苗保护率仅为20%~30%，而皮卡狂犬病疫苗可高达70%~100%。统计学分析有极其显著的差异(待发表资料)。这些机体的显著效果是上述细胞和亚细胞水平效果的总结。另外，皮卡乙肝疫苗，皮卡流感疫苗、皮卡结核病疫苗(与美国国际结核病疫苗基金会AERAS协作)都取得符合上述免疫机理的结果，其中皮卡狂犬病疫苗、皮卡乙肝疫苗已在新加坡取得临床研究批件，已经开始了人体临床研究。
关于皮卡佐剂疫苗安全性[21]：
皮卡(PICKCa)是聚肌苷酸(PI)、聚胞苷酸(PC)、卡那霉素(K)、氯化钙(Ca)的复合物，国内商品名称为聚肌胞注射液，这是我国独有的具有国家标准的人用注射药品[22]。1981年，经国家批准用于临床，很
林海祥，张译
多厂家投入生产，产量达每年几千万支。浙江万马药业有限公司自1984年开始销售聚肌胞注射液，临床使用未发现严重的不良反应。该公司1999年销售1432.02万支，2000年销售1764.47万支，2001年销售1320.88万支。
关于皮卡疫苗我们已申请并已获得临床研究的有皮卡狂犬病疫苗、皮卡乙肝疫苗，其中的疫苗也都是具有国家标准批准生产的疫苗。皮卡佐剂与疫苗复合后不仅符合甚至高于两个国家标准的要求，这是由于皮卡佐剂提高了疫苗免疫原性，使疫苗用量较单纯疫苗少，如皮卡狂犬病疫苗蛋白含量由原来的120 μg改为80 μg，硫柳汞含量由原来的应不高于0.10 mg/ml改为0.02~0.08 mg/ml，效力测定由原来的≥2.5 IU/ml改为≥4.0 IU/ml等。并增加了本疫苗特有的皮卡含量、皮卡相对分子质量以及诱导细胞免疫的检定。同时也不增加疫苗中原有的一些物质(如残留小牛血清)可能产生的不良反应。这两个疫苗都通过了临床前研究的各项检定，包括急性、慢性、重复毒性和猴体安全评价。
病毒感染仍然使人类面临重大威胁：HIV已成为死亡的第四大因素；新病毒性疾病的出现：Sars，禽流感和最新在国际流行国内也检出的中东呼吸综合征(MERS)；某些地域性病毒病在全球播散：拉萨热、艾博拉；旧病毒病重新播散：麻疹；致癌病毒：EB病毒、人乳头瘤病毒、性疱疹病毒、乙肝病毒等。面对这些疾病人们缺乏根本有效的对应办法。如对SARS和MERS，只能采取对症治疗，对密切接触者采取隔离措施；乙肝疫苗只能用于预防，对病毒携带者和患者无效；即使潜伏期很长的狂犬病而且认为有效的狂犬病疫苗对咬伤患者也不是足够的，须联合应用抗狂犬病免疫球蛋白。皮卡疫苗作用机理已基本清楚，既提高疫苗免疫原性又改变免疫类型具有强烈的细胞免疫而可防可治，是解决人类当前很多难题的新途径！
自从证实ds RNA是多种膜式受体的配体，是优秀的疫苗佐剂，已引起极大关注，成为热门研究课题[23]-[26]。然而单纯PIC易被人及灵长目动物血清中的核酸酶水解而难以在机体内发挥效用[27]，Levy 等研制出PICLC，即PIC与聚赖氨酸(PolyL-lysine，相对分子质量27,000)和羧甲基纤维素CMC，相对分子质量700 000)的结合物，使相对分子质量增大了许多，可以抵抗酶水解，在人和灵长目动物中诱生出较PIC高得多的干扰素[28] [29]，但PICLC毒副作用严重，可以引起发烧(100%)，肌痛(50%)，低血压(50%)，白细胞明显下降等，难于应用于人体[30]。幸运的是将PICKCa作为疫苗佐剂是我们的首创，已在35个国家和地区获得发明专利，以致美国AERAS比较若干佐剂后来华寻求皮卡专利使用权。我们应该应用皮卡佐剂加紧抗病毒、抗肿瘤疫苗的研究，希望能引起国家和社会的重视和支持，使有可能为国分忧、为患者解除病痛的具有中国自主知识产权的皮卡疫苗早日问世。
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治疗性疫苗
治疗性疫苗 预防性疫苗是用免疫手段将预防传染病的抗原通过适宜途径种入人体，模拟一个轻度的自然感染或刺激机体 产生免疫应答，诱发、促使机体处于免疫状态，产生自 动免疫力，从而增强个体和群体的对抗相应传染病的能 力，达到预防疾病的目的。 所谓治疗性疫苗是指在已感染病原生物或患某些疾病的机体中，可诱导机体产生特异性或非特异性免疫应答，从而达到治疗疾病的制品。 治疗性疫苗的分类： 按是否有病原生物感染，分为感染型和非感染型治疗性疫苗。如乙型肝炎病毒感染治疗性疫苗、人类免疫缺陷 病毒感染治疗性疫苗、金黄色葡萄球菌感染治疗性疫苗、疟原虫感染治疗性疫苗等。 按针对的疾病不同，分为肿瘤治疗性疫苗、高血压治疗性疫苗、糖尿病治疗性疫苗、早老性痴呆治疗性疫苗、 类风湿关节炎治疗性疫苗、艾滋病治疗性疫苗、疟疾治 疗性疫苗等。 按免疫原的种类不同，分为肽和蛋白型治疗性疫苗、核酸型治疗性疫苗、细胞型治疗性疫苗，后者如T细胞治 疗性疫苗、树突状细胞治疗性疫苗、肿瘤细胞治疗性疫 苗。
1．肽疫苗的主要技术路线： （1）抗原表位的筛选，这是肽疫苗设计和有效的关键； （2）人工合成；或将抗原表位基因插入表达载体，转入原核或真核系统，表达出抗原短肽； （3）免疫动物； （4）检测细胞免疫和体液免疫，评价免疫保护效果。 2.核酸疫苗的主要技术路线： 1）选择目的基因； （2）选择合适的真核质粒表达载体； （3）构建重组子并纯化； （4）转染哺乳动物细胞（以含有报告基因的表达载体作对照），检测相应蛋白的表达； （5）疫苗接种，可经肌肉、皮下或粘膜等途径； （6）检测体液免疫和细胞免疫功能，评价免疫保护效果。 3.核酸疫苗的优点： （1）免疫效果好，能全面激活机体免疫应答。DNA苗接种后在机体内以天然抗原形式表达其抗原物质，被免疫系统识别，同时诱导体液免疫和细胞免疫应答，免疫应答全面； （2）效应长。一次接种可诱导长期免疫应答，对不同亚型有交叉保护作用；
佐剂的研究现状课稿
佐剂的研究现状 【摘要】随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展,对佐剂的研究显得越来越重要，本文通过查阅近几年相关文献，综合免疫佐剂研究多方面资料和最新观点，就免疫佐剂研究概况作一综述，着重介绍几种新型的佐剂的特点，并就其发展趋势提出自己的见解，为开发研制高效、低毒、结构新颖的免疫佐剂提供参考。 【关键字】免疫佐剂研究 佐剂是先于抗原或同时注射于动物体内，能非特异性地改变机体对抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂。从巴斯德至今近百年来已开发了许多菌苗和疫苗，但传统的菌疫苗一般多为全菌或全病毒制成，其中含有大量非免疫原性物质，这些物质除具有毒副作用外也有佐剂作用，所以一般不需要外加佐剂。因此,在这段时间里免疫佐剂并未引起人们广泛的注意，直到1925年，法国免疫学家兼兽医Gaston Ramon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应[1]，从此许多国家都不同程度的开展了这方面的研究。现在,由于高度纯化的新型疫苗的生产技术不断取得突破，而常规的佐剂由于其自身的缺陷使之很难适应新型疫苗的发展，因此新的研究工作已经逐渐引起科研工作者的注意。 20世纪60年代，原苏联喀山医学院就对蜂胶影响动物机体免疫活性方面进行了观察，通过对小鼠、豚鼠、家兔等实验证明应用蜂胶或配合抗原进入机体，能促进机体免疫过程。1981年Kreuter首次将纳米材料应用于疫苗佐剂，证明纳米粒子佐剂既能提高细胞免疫，又能提高体液免疫。1998年Moldoveanu 等最早报道CpG ODN 联合灭活流感病毒免疫小鼠能诱导产生比常规佐剂更高的血清特异性抗体。这些新型佐剂能克服常规佐剂的一些缺陷，因而受到国内外学者越来越多的关注。目前我国常用的佐剂有铝盐、油乳、蜂胶、多糖、微生物、氟氏（FA）佐剂、γ- 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素(Interleuki-ns，ILs)、免疫刺激复合物（ISCOMs）、糖苷及复方中药佐剂等，新型免疫佐剂有核酸、CpG、补体、纳米、脂质体（LIP）等。下面就几种免疫佐剂的研究现状和应用前景进行简要的综述。 1 佐剂作用机理 Cox[2]等提出了佐剂增强免疫应答5种可能的机制: 1.1 免疫调节作用 众多佐剂具有调节细胞因子网络的能力。不同的佐剂诱导抗原提呈细胞分泌不同的细胞因子，促使Th前体细胞向Th1或Th2不同的亚型分化。 1.2 抗原提呈作用 某些佐剂能保持抗原构象的完整性，并将其呈递给合适的免疫效应因子。当佐剂与抗原以更有效的维护构象表位的方式结合时，可提高抗原的体内作用,延长抗原屏蔽时间. 1.3 诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL) 应答通过与细胞膜融合或保护抗原肽，佐剂可促进相应肽掺入MHC类分子并维持二者结合，同时期望通过诱导IFN-γ和TNF-α来提高肽MHC类分子的表达。
蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展
蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展 摘要蜂胶是一种天然的免疫增强剂，在体内能激活免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。近年来，大量的研究表明蜂胶可作为疫苗和菌苗的免疫佐剂来增强疫苗的免疫效果。本文综述了蜂胶作为疫苗佐剂的研究进展。关键词：蜂胶；疫苗佐剂，免疫应答 蜂胶是蜜蜂从杨树等植物的的嫩芽、树皮或茎干伤口上等部位采集的树脂，再混以蜜蜂的舌腺、蜡腺等腺体分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质[1]。蜂胶属树脂类物质，极易溶于乙醚、氯仿、丙酮、苯及2％NaOH 溶液，溶于95％乙醇。溶液呈透明状，随蜂胶浓度的增大，有颗粒状沉淀析出[2]。近年来研究人员已经对蜂胶的抗菌活性进行了深入研究，并且已经证明了蜂胶的抗菌活性(Grange and Davey, 1990; Kujumgiev et al., 1999; Sforcin et al., 2000; Orsi et al., 2005c, 2006b; Scazzocchio et al., 2006)[3-6]. 蜂胶也具有抗病毒(Amoros et al., 1992; Serkedjieva et al., 1992; Vynograd et al., 2000; Ito et al., 2001; Huleihel and Isanu, 2002; Gekker et al., 2005)[7-12], 抗真菌(Dobrowolski et al., 1991; Sforcin et al., 2001)[13-14] ,以及抗寄生虫的作用(Higashi and De Castro, 1994; De Castro and Higashi, 1995; Salom?ao et al., 2004; Freitas et al., 2006)[15-18]，其高强度和黏度、杀菌防腐能力都是其他天然品无法比拟的。它是天然药材、辅料及兽药、医药、植物和肉食品加工、食品防腐保鲜的好材料。被誉为“人类健康的紫色黄金”。它的主要功效成分是黄酮类化合物[19]。大量研究表明，蜂胶或者蜂胶提取物能够激活小鼠和人的免疫系统，增加IL-1(Ivanovska et al., 1995; Bratter et al., 1999; Orsolic and Basic, 2003), IL-2 (Ivanovska et al., 1995; Park et al.,2004), IL-4 (Park et al., 2004) ，以及抗体的产生 (Scheller et al., 1988; Park et al., 2004)[20-23]。几十年来，国内外大量科研实验证明，将蜂胶配合抗原引入机体，能增加抗体产生，还能对胸腺、脾脏及整个免疫系统产生有益的影响，显著增强机体免疫功能，使机体免疫功能处于动态平衡的最佳状态。
疫苗佐剂综述汇编
疫苗佐剂综述 近三十年来，人用疫苗佐剂发展迅速，已经研发出了能诱发更强，更持久的人用疫苗佐剂。但是还存在一些不足之处，理想的疫苗佐剂应该更适于临床应用，毒副作用更小。本文总结了当前疫苗佐剂的发展状况，其中包括疫苗佐剂的监管建议，理想佐剂的标准，以及详细介绍了诸如矿物盐类佐剂，毒素类佐剂，微生物衍生物类佐剂，油乳剂，细胞因子佐剂，多糖类佐剂，以及核酸佐剂。同时本文还讨论了最近新发现的Toll样受体的生物学作用以及在免疫激活中发挥的作用。 关键词：疫苗；佐剂；Toll样受体； 1 引言 免疫接种的目的就是要获得对疾病持久的免疫保护反应。与弱毒疫苗不同，灭活疫苗或亚单位疫苗通需要疫苗佐剂的参与才能更好的发挥作用【1】。“佐剂”一次来自于拉丁语“Adjuvare”一词，为“帮助”或“辅助”之意【2】。免疫佐剂的生物作用包括：（1）抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；（2）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（4）佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；（5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；（7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。人们正是因为观察到疫苗接种位点处形成的脓肿协助机体产生了针对特异性抗原更强的免疫反应，从而形成了疫苗佐剂的理念。更有甚，与接种抗原不相关的物质形成的脓肿坏死也能增强疫苗的特异性免疫反应【3,4】。 1926年，通过吸附于铝盐类化合物的白喉类毒素首次证明了铝盐类佐剂的免疫增强作用。至今，铝盐类佐剂（主要指氢氧化铝和磷酸铝）依然是唯一人用疫苗佐剂。其原因是什么呢？尽管大量事实证明，弗氏完全佐剂和脂多糖类佐剂具有更强的佐剂活性，但由于其能引发局部和全身性的毒副作用而不适于人用。这也正是铝盐类佐剂作为人用疫苗佐剂80余年的原因所在。在今后的80年中，铝盐是否依然是人用的唯一疫苗佐剂？答案是肯定的。自批准铝盐作为人用疫苗佐剂以后，管理部门对人用疫苗佐剂的要求提高了很多。而且，用于评价疫苗佐剂安全性的后期临床试验花费日益昂贵。一旦通过200至500人安全性和效用性实验后，在疫苗佐剂审批注册之前还需要进行5000至25000人数的临床试验。正因为如此，在接下来的10至20年之间，几乎没有哪种佐剂能通过疫苗佐剂审批。 2 理想的疫苗佐剂 免疫接种时需要考虑以下几点：抗原种类，接种动物种类，免疫途径，以及可能产生的免疫副作用【10,11】。理想的佐剂半衰期长，生物体内可以降解，生产成本低，能诱导产生合适的免疫反应（也就是根据感染病原的不
疫苗佐剂的研究进展
疫苗佐剂的研究进展 一、佐剂的定义 佐剂（Adjuvant）又称免疫调节剂（Immunomodulator）或免疫增强剂（Immunomodulator），是指先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的一类物质。佐剂的英文名adjuvant来源于拉丁文“adjuvare”,意思为“帮助”。药物佐剂，即某种可以加强药物疗效的物质。 二、佐剂的作用 佐剂可增强抗原的免疫原性、免疫应答速度及耐受性，可调节抗体对抗原的亲和性与专一性，可刺激细胞介导的免疫，可促进肠胃粘膜对疫苗的吸收。佐剂的作用机制当前了解的很少，阻碍了设计新的佐剂化合物，佐剂常激活多个免疫链，其中只有少数与抗原特异应答相关，要想确切地知道佐剂的作用很困难。 佐剂能增加对细胞的渗入性，防止抗原降解，能将抗原运输到特异的抗原呈递细(APC5)，增强抗原的呈递或诱导细胞因子的释放。在注射抗原后，抗原可直接被APC5吸收，与B细胞表面抗体结合或发生降解，抗原的吸收途径主要取决于抗原的特征，但也受佐剂影响。被APC5吸收的抗原通过两种途径MHCI或MHCII而呈递于CD8+或CD4+T细胞上。根据注射疫苗后分泌细胞因子方式的不同，可分为Th1应答与Th2应答。Th1应答主要通过诱导分泌IFN-γ, IL-2和IL-12，而Th2应答是通过诱导分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-12，不同的细胞因子分泌模式是相互拈抗的，促进一种
应答形式常会抑制另一种应答形式，产生I g G2a抗体被认为是Th1应答，然而诱导产生I g G1常与Th2应答有关。不同的佐剂虽然可诱导相似的抗体水平，但是细胞因子应答的方式可能不同，Th1或Th2应答方式对于疫苗的功效有显著的影响。 评价佐剂质量的优劣或能否适用于人用疫苗疫苗的主要因素为： ①能使弱抗原产生满意的免疫效果； ②不得引起中等强度以上的全身反应和严重的局部反应，在局部贮留的硬结必须逐渐被吸收； ③不得因其对佐剂本身的超敏反应，不应与自然发生的血清抗体结合而形成有害的免疫复合物； ④不得引起自身免疫性疾病； ⑤既不能有致癌性，也不得有致畸型性； ⑥佐剂的化学组成应明确，物理和化学性质稳定； ⑦在一定的保存期内的疫苗佐剂,应该稳定有效。 这些因素必须权衡考虑，但是副作用是其中最重要的一个因素，应考虑是局部反应还是全身反应，以及副反应的程度是否能被使用者接受；免疫促进作用可能刺激体液免疫和细胞免疫，或者两者均有，并且与不同疫苗的抗原成分和免疫途径有关；经济方面应考虑佐剂的来源，材料及制造工艺的价格。还应考虑到使用佐剂后是否能减少疫苗的免疫剂量及次数，以及免疫力持续的时间长短等。 在疫苗中应用免疫佐剂的潜在优点包括： 1.能优化免疫应答；
佐剂
1、我用两个注射器进行等量抗原与弗氏不完全佐剂的乳化,可是乳化了四个多小时后,滴在冰水里还是很快扩散,麻烦各位帮忙分析一下乳化失败的原因,多谢! 弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可 根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂。上述佐剂经高压灭菌后，低温保存备用。 在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，制备成"油包水"乳 状液。佐剂和抗原体积比一般为1：1。佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：（1）研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。 （2）注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，适用于制备少量的抗原乳剂。制备好的乳化剂经鉴定才能适用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。可以取弗式不完全佐剂滴在水里试试，看看是不是佐剂的问题！wo 我们常常用很细的匀浆器来乳化，很好用注意把水相推到油相，我试过，这样大概十几分钟就乳化好了，反过来可能怎么都不好（有两次我推反了足足2个小时我手都快抽筋了都不好），原理是油包水型的是水到大量的油中才行，反过来就成水包油了，在药剂书上有 弗氏佐剂 弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗（最终浓度为2～20mg/ml）或死的 结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。一般首次注射时用1／2体积FCA 加上1／2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。
疫苗佐剂的现状和未来
疫苗佐剂的现状和未来发展趋势 当今使用的单纯重组和人工合成抗原制成的疫苗存在一些不足，这些抗原的免疫原性远不及传统活疫苗或灭活疫苗。因此，这类疫苗的使用就需要功能强大的疫苗佐剂的辅助。毫无疑问，目前在世界范围内大部分国家铝佐剂依然是唯一可用于人的疫苗佐剂。虽然铝佐剂能诱导产生体液免疫反应，但是对细胞免疫的刺激几乎不起任何作用，而细胞免疫对许多病原体的免疫保护至关重要。另外，铝佐剂引起剧烈的局部和全身性副作用，能引起肉芽肿、嗜伊红血球过多和肌筋膜炎，但是这些剧烈副作用很少发生。也有人担心铝佐剂能引起诸如老年痴呆症之类的神经退化性疾病。因此，当前急需安全、高效，适合人类使用的疫苗佐剂，特别是能激发细胞免疫的安全无毒佐剂。鉴于当前的新型疫苗技术，需要适合黏膜递呈类疫苗、DNA疫苗、癌症和自身免疫类疫苗的佐剂。这些领域中，每一种疫苗的发展都与之相应的佐剂技术密切相关。本文回顾了疫苗佐剂的当前现状，探求未来的发展方向，最后提出人类疫苗佐剂发展和审批的障碍和阻力。 关键词：佐剂，免疫反应，黏膜免疫，疫苗 佐剂起源 免疫接种的目的是诱发机体产生对接种抗原强大的免疫反应，以保护机体免受相应病原体的侵袭。为了达到此目的，和减毒疫苗相比，灭活疫苗需要佐剂的协助。佐剂是一类能增强针对一同接种的抗原特异性免疫反应的物质。“佐剂”一词来源于拉丁语“adjuvare”，是协助和增强之意。佐剂概念最早起源于二十世纪二十年代，Ramon等人发现接种白喉类毒素疫苗部位形成脓肿的马产生更高的特异性抗体。随后他们发现，脓肿的形成能增强机体对类毒素的免疫反应，脓肿则是接种时引入与白喉类毒素不相关的物质引起。1926年Glenny等人通过吸附于铝佐剂的白喉类毒素证明了铝佐剂的佐剂活性。至今，铝盐类复合物（主要是磷酸铝和氢氧化铝胶）依然是人用疫苗的只主要佐剂。1936年，Freund开发出含有分枝杆菌的水和矿物油乳剂，从而研制出目前所知佐剂中效力最最强的佐剂——弗氏完全佐剂。尽管复试弗氏完全佐剂作为佐剂的黄金标准，但是此种佐剂能引起剧烈的局部反应，不能作为人用疫苗佐剂。不含分分枝杆菌的水包油乳
免疫佐剂：疫苗研究中的首要问题
免疫佐剂：疫苗研究中的首要问题 摘要：2009年7月欧洲委员会在布鲁塞尔召开了免疫佐剂研讨会，这次研讨会的主要目的是确定科学研究中需要优先考虑的问题。他们属于研发有效疫苗中的一部分，这些疫苗主要用于预防那些威胁生命的疾病，特别是与贫困有关的疾病，诸如：艾滋病病毒∕艾滋病、疟疾、肺结核以及被忽视的传染病。免疫佐剂和相关技术的新进展以及潜在挑战、障碍的排除，认为六个问题是加快人用新型免疫佐剂发展需要优先考虑的问题。 1.对新型免疫佐剂的迫切需求 当前迫切需要预防那些威胁生命的疾病特别是与贫困有关疾病的疫苗。 当前调查研究中的大部分疫苗抗原是有高纯度的重组分子和病原体亚单位组成，所以通常缺少病原体的一些特征，包括刺激固有免疫反应的特性。因此这些疫苗通常不能诱导强烈的免疫反应，尽管对大量的佐剂都有评价，但是以铝为基础的矿物盐（明矾）佐剂依旧是当前世界范围内人类广泛使用的佐剂。通过过去的记录可知明矾的安全性很好，在预防传染病所用的疫苗中，通常用明矾作为佐剂。通过抗体反应可以阻止传染病的发生，因此在许多已经批准的疫苗中明矾佐剂效果很好。然而，明矾也存在着一些局限性，对于小分子肽以及某些疫苗（如伤寒疫苗、流感疫苗）不能增强抗体应答反应。 尤其是明矾在诱导细胞毒性T细胞和辅助性T细胞反应时作用甚微，而细胞毒性T细胞和辅助性T细胞是预防阻止对生命造成威胁的感染所必须的。因此当前的迫切任务是开发新型佐剂辅助疫苗解决那些至今不能用传统方法解决的病原体，以及克服已批准可应用佐剂的局限性。 2. 粘膜佐剂：最需优先考虑的问题 大部分病原体，包括艾滋病病毒和分枝结核杆菌侵入人类宿主，在粘膜表面建立感染。然而，现存的大多数疫苗都是注射途径来进行免疫的。通过诱导局部特定病原体免疫反应，粘膜免疫接种具有在入口处阻止粘膜转移病原体侵入的潜力，因此可以增强疫苗的免疫功效。把粘膜诱导点作为目标在其他距离远的粘膜表面也能诱导免疫反应。粘膜免疫与通过注射接种的疫苗相比有潜在的优势，如
FDA批准一种治疗性癌症疫苗产品
FDA批准一种治疗性癌症疫苗产品 2010年4月，在经历了多年挫败之后，美国食品与药品监督管理局（FDA）终于通过了第一款治疗性癌症疫苗产品。这就是由美国华盛顿州西雅图市Dendreon公司生产的Provenge （sipuleucel-T）。该疫苗能够使晚期前列腺癌患者的生命延长好几个月。美国马里兰州贝塞斯达美国癌症研究院（National Cancer Institute）的肿瘤医学专家James Gulley认为，Provenge疫苗的成功让其它几款癌症疫苗看到了希望。 他指出，FDA在批准Provenge疫苗时需要克服一些管理方面的问题，所以Provenge疫苗无疑是癌症疫苗发展史上的一座里程碑，它为后续的癌症疫苗产品趟开了一条新路。 在近三年时间里，癌症疫苗的研发工作开展得如火如荼，Gulley认为这部分得益于Provenge疫苗的成功，以及其它几款在晚期临床试验中取得突出表现的癌症疫苗的功劳。大型制药公司们都在启动各自的治疗用疫苗（therapeutic-vaccine）商业项目，小型生物技术公司们也对癌症疫苗研发工作表现出了强烈的兴趣。 在美国，有数百个癌症疫苗的临床试验项目正在开展，美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学悉尼金梅尔综合癌症中心（Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center at Johns Hopkins University）的肿瘤学家Hyam Levitsky认为，现在，癌症疫苗研究领域的前景要比过去20年间任何时候都要光明得多。Levitsky介绍说，每一个打算进入癌症疫苗研发领域的人都会得到这样的保证——“这一行绝对有前途。”
CpG_DNA疫苗佐剂研究进展及其应用前景
of survivin and it s splice variant s in endometriosis[J ].Mol Hum Reprod ,2006,12(6):3832388 [6]Kayaseleuk F ,Nursal TZ ,Polat A ,et al.Expression of survivin , bcl 22,P53and bax in breast carcinoma and ductal intraepit helial neoplasia (DIN 1a )[J ].J Exp Clin Cancer Res ,2004,23(1):1052112. [7]Beardmore VA ,Ahonen LJ ,G orbsky G J ,et al.Survivin dynamics increases at centromeres during G2/M phase transition and is reg 2ulated by microtubule 2attachment and Aurora B kinase activity [J ].J Cell Sci ,2004,117(Pt 18):403324042. [8]Wolanin K ,Magalska A ,Mosieniak G ,et al.Curcum in affect s component s of t he chromosomal passenger complex and induces mitotic catastrophe in apoptosisresistant Bcr 2Abl 2expressing cells [J ].Mol Cancer Res ,2006,4(7):4572469. [9]Ohashi H ,Takagi H.Phosphatidylinositol 32kinase/Akt regulates angiotensin II 2induced inhibition of apoptosis in microvascular en 2dot helial cells by governing survivin expression and suppression of caspase 23activity [J ].Circ Res ,2004,94(6):7852793. [10]Kwon K B ,K im EK ,Lim J G ,et al.Molecular mechanisms of ap 2 optosis induced by Scorpio water extract in human hepatoma Hep G2cells[J ].World J Gastroenterol ,2005,11(7):9432947.[11]Jing Z ,Nan K J ,Hu ML.Cell proliferation ,apoptosis and t he re 2 lated regulators p27,p53expression in hepatocellular carcinoma [J ].World J Gastroenterol ,2005,11(13):191021916. [12]Muo J D ,Wu P ,Xia XH ,et al.Correlation between expression of gastrin ,somatostatin and cell apoptosis regulation gene bcl 22/bax in large intestine carcinoma [J ].World J Gastroentero1,2005,11(5):7212725. [13]Marusawa H ,Mat suzawa S ,Welsh K ,et al.HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis suppression [J ].EMBO J , 2003,22(11):272922740. [14]K im J Y ,Chung J Y ,Lee SG ,et al.Nuclear interaction of Smac/ DIABLO wit h Survivin at G2/M arrest prompt s docetaxel 2in 2duced apoptosis in DU145prostate cancer cells[J ].Biochem Bio 2phys Res Commun ,2006,350(4):9492954. [15]Shiozaki A ,Kataoka K ,Fujimura M ,et al.Survivin inhibit s apop 2 tosis in cytotrophoblast s[J ].Placenta ,2003,24(1):65276.[16]冯苗,王自能,杨艳东.survivin (存活素)在早孕绒毛及妊娠滋养 细胞疾病中的表达[J ].暨南大学学报:医学版.2005,26(2): 1852189. [17]Zwert s F ,Lupu F ,De Vriese A ,et https://www.360docs.net/doc/866692883.html,ck of endot helial cell survivin causes embryonic defect s in angiogenesis ,cardiogenesis ,and neural tube closure [J ].Blood ,2007,109(11):474224752.[18]韦枝红,龙淑芳,宁克勤.复发性自然流产患者妊娠组织中Sur 2 vivin 的异常表达[J ].临床和实验医学杂志,2006,5(7):8592860. [19]Chen J ,Wu W ,Tahir SK ,et al.Down 2regulation of survivin by antisense oligonucleotides increases apoptosis ,inhibit s cytokine 2sis and anchorage 2independent growt h [J ].Neoplasia ,2000,2(3):2352241. [20]陈彩蓉,王自能,郭晓燕.过期妊娠胎盘滋养细胞Survivin 表达 情况的研究[J ].右江医学,2008,36(3):2552256. [21]Allaire AD ,Ballenger KA ,Wells SR ,et al.Placental apoptosis in preeclampsia[J ].Obstet Gynecol ,2000,96(2):2712276.[22]孙丽洲,赵文英,洪蕾,等.妊娠高血压综合征患者胎盘滋养细胞 凋亡基因表达谱的研究[J ].中华妇产科杂志,2003,38(10): 6042607. 收稿日期:2009208217;修回日期:2009209221 (本文编辑:黄春燕) 第一作者简介:郑亮(1983— ),男,在读硕士,研究营养与食品卫生。作者单位:福建医科大学公共卫生学院营养与保健医学系,福州 350004。 3通讯作者:吴小南,男,教授,博士,从事营养与保健资源开发研究。 文章编号:100722705(2010)022******* 中图分类号:R 392233 文献标识码:A 【综述】 Cp G 2DNA 疫苗佐剂研究进展及其应用前景 郑亮,吴小南3 摘要:阐述疫苗佐剂的研究进展与传统佐剂的局限和缺点。介绍Cp G 2DNA 的发展历程、作用特点和机制等;并 展示其在传染病预防、疾病治疗及食品卫生、人群健康等领域的应用前景,为新型佐剂的研究和应用提供理论依据。 关键词:Cp G 2DNA ;免疫活性;佐剂;疫苗佐剂;toll 样受体 疫苗佐剂的发现至今不到100年,却在增强疫苗免疫活性方面起着重要作用。而随着新型疫苗的不断推出,新型疫苗佐剂的设计与开发已迫在眉睫,并已成为目前疫苗研究的热点。Cp G 2DNA 在新型佐剂中较有代表性,由于能与细胞膜上的Toll 样受体结合,诱导多种细胞因子产生,诱导Th2型免疫应答向Th1转换,从而激发细胞免疫,是连接天然和获得性免疫的重要纽带,被认为是有潜力的新型疫苗佐剂之一[1]。本文就疫苗佐剂的研究进展,特别是Cp G 2DNA 疫苗 佐剂的发展历程、作用特点和机制及应用前景进行综述。 1 疫苗佐剂的研究进展 佐剂(adjuvant )又称免疫调节剂或免疫增强剂,是指先于 抗原或与抗原混合或同时注入动物体内,能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥辅助作用的一类物质。111 常用疫苗佐剂及其缺点 常用的佐剂主要有不溶性铝盐类胶体、油水乳剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、免疫刺激复合物、蜂胶和脂质体等。这些佐剂主要通过免疫调节、参与抗原递呈、诱导CD8+T 细胞应答和抗原贮存等方式发挥作用。各种佐剂中,使用最早、最广泛的为铝盐佐剂。铝盐佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的
575-关于高血压治疗性疫苗的研究进展
关于高血压治疗性疫苗的研究进展 通讯作者:袁如玉,Email:yuanruyu@https://www.360docs.net/doc/866692883.html, 邢 艇,袁如玉 (天津医科大学第二附属医院心脏科,天津300211) 关键词:高血压;疫苗;血管紧张素类;病毒;病人依从 中图分类号:R544.1 文献标识码:A 文章编号:10042583X(2009)1721553203 高血压是内科最常见的疾病之一,而高血压治疗的主要手段仍是依靠降压药物和改善生活方式,需要长期甚至终生的治疗,由于多种原因,患者或不能坚持治疗,或未能降压达标,直接导致高血压控制率不高,这是目前高血压治疗领域的主要问题之一。因此,积极探索新的治疗方法和手段,一直是世界各国心血管基础与临床工作者探讨的问题和研究的热点[1]。对于高血压发病机制的研究表明,肾素2血管紧张素系统(RAS)的异常激活使血压升高,而长时间血压升高使血管发生病理重塑,并引发心、脑、肾等靶器官损伤,故RAS成为高血压化学药物治疗的主要靶点,临床上应用血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)均获得了良好的降压及靶器官保护疗效,所以研究者继续针对该系统尝试应用免疫阻滞的手段来阻滞RAS的各个环节,从而达到治疗高血压的目的[2]。关于高血压治疗性疫苗的研究,再次进入业内人士的视线。 1 高血压疫苗的定义及作用机制 高血压疫苗主要指的是治疗性疫苗即针对慢性反应,在体内产生持续性的自身抗体从而发挥其作用,不同于传统的预防性疫苗,它是利用疫苗来诱导和增强抗体特定的免疫反应,以达到有效控制病情的目的。这种疫苗作用于人体的RAS,该系统目前被认为是引起大多数高血压的主要发病机制。疫苗把RAS的抗原引到人体,通过转染技术,把抗原和病毒结合,注射到人体,人体就会产生相应抗体,抗体持续地作用于RAS。研究者介绍,他们使用了一种病毒样的颗粒,在化学结构上将其与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)结合,这样人体会对AngⅡ产生强烈的抗体反应,从而降低血液中血管紧张素的含量。 治疗性疫苗主要分为3类:①肾素2血管紧张素疫苗,主要阻断位于上游的肾素,从而从源头上减少了下游的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)及Ⅱ在血液中的浓度,同时也降低了负反馈作用所致的肾素水平的升高,但是主要的缺陷为靶器官的损害较高。②AngⅠ及Ⅱ的中和抗体疫苗,主要依靠该抗体的中和作用减少了血管紧张素的作用,但是存在的问题是此中和抗体能否完全中和血管紧张素的作用,同时靶器官的保护作用较差。③AngⅡ受体的短肽疫苗,即类似于ARB,具有降压,减少全身血流量的作用,但其具有反馈性肾素升高的缺陷。 高血压形成的主要机制是小动脉的收缩和体内钠水滞留的结果。引起小动脉的收缩和体内钠水滞留的主要原因是体内生成过量的具有该作用的生物活性因子。目前使用的降压药是扩张血管和减轻钠水潴留,企图拮抗这些生物活性因子的生物学作用,达到降压的目的。但这样做的结果不能清除体内过量的生物因子,而且机体常通过反馈机制使已经过量的因子进一步的升高。因此治疗结果常使高血压的缓解是暂时的,疗效难持久。使用疫苗的主动免疫原理是直接针对体内过量的生物活性因子,用免疫学原理中和它们的生物活性,并将其清除出体外。高血压疫苗中和生物活性因子的作用不仅可以治疗高血压,更有疗效持久的优点,因此受到各国研究者的关注。 2 高血压疫苗的发展过程及进展 这种治疗性疫苗1953年就已进入了研究者的视野。第1个抗体对象是肾素,抑制肾素活性是抑制RAS的初始步骤,抑制该系统的限速酶,理论上是最好的疫苗设计靶点,但在动物研究中发现,由于肾素蛋白有良好的免疫原性,使得血压下降的同时,动物肾脏出现严重的自身免疫反应,因而肾素疫苗的安全性问题阻碍了其进一步发展。此后50多年研究者进行了许多尝试但进展不大。 2004年,Brown等[3]报道英国学者开发了AngI疫苗2 PMD3117,并进行临床试验,完成免疫程序后,在高血压患者体内疫苗产生了高滴度抗体并能维持较长时间,但患者在撤停ACEI和ARB类降压药物后血压出现反弹。同时观察到患者体内的醛固酮分泌受到了明显抑制,说明该疫苗能对RAS产生抑制作用,血压不能维持的原因考虑为抗体还未达到足够高的滴度。 从21世纪起,AngⅡ短肽的类似疫苗开始出现,并在取得了Ⅰ期及Ⅱa期临床试验成功的基础上,又使此治疗性疫苗成为研究的热点。目前疫苗的研究主要集中在血管紧张素这一环节。 2007年,瑞士Cytos生物公司宣布,已完成Ⅱa期临床研究并已公布结果。Tissot等[4]报道Bachmann等用针对Ang Ⅱ的抗高血压疫苗,该疫苗名为C YT0062AngQ6,内含Ang Ⅱ多肽与病毒颗粒结合在一起形成抗原,激发体内生成抗AngⅡ抗体。C YT0062AngQ6在大鼠、小鼠实验具有高度免疫功能,400μg可降血压21mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)。血液内AngⅡ浓度较单用病毒颗粒对照组增加9倍,有效地阻断了RAS。与雷米普利(一种ACEI制剂)比较,两组效果类似[5]。在临床研究方面:安全性研究,临床Ⅰ期志愿者12例分别注射C YT0062AngQ6100μg或安慰剂,观察4周,无不良反应。正常血压的人血压无变化,2周后血液内AngⅡ抗体增加。临床Ⅱa期研究收治72例轻中度高血压(140～179/90～109mm Hg)患者,随机、双盲、安慰剂对照研究,被注射了100μg或300μg的疫苗或者安慰剂。这些患者平均年龄为51.5岁。研究开始后,在0、4及12周时进行疫苗
皮卡佐剂及其治疗性疫苗作用机理
Open Journal of Nature Science 自然科学, 2015, 3(3), 70-80 Published Online August 2015 in Hans. https://www.360docs.net/doc/866692883.html,/journal/ojns https://www.360docs.net/doc/866692883.html,/10.12677/ojns.2015.33010 Mechanisem of Action of PICKCa Adjuvant and Its Therapeutic Vaccines Haixiang Lin*, Yi Zhang Beijing Yishengxingye Science and Technology Co. Ltd., Beijing Email: *haixianglin510@https://www.360docs.net/doc/866692883.html, Received: Jul. 27th, 2015; accepted: Aug. 14th, 2015; published Aug. 21st, 2015 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/866692883.html,/licenses/by/4.0/ Abstract PICKCa, a safe vaccine adjuvant for human use, is a complex of poly IC-kanamycin-Cacl2. It is the li-gand of pattern recognition receptors of TLR3, NOD and RIG-1. PICKCa vaccines can activate innate pathways in vivo to produce cytokines including IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-12p40, IL-6, TNF-α, promote macrophage function, stimulate antigen-presenting cells to produce co-stimulators of CD40, CD80, CD86, activate cell-mediated immunity and humoral immunity. Due to PICKCa adjuvant en-hancing productions of IFN, IL-2, IL-12, the adjuvant may make prophylactic vaccines from main humoral immunity to possess strong cell-mediated immunity as therapeutic vaccines. In 3 indepen-dent assays of post-explosure immunizations of mice and beagle dogs, PICKCa rabies vaccine was much better than commercial adjuvant-free rabies vaccines, the protective rate was 70% - 100% and 20% - 30% respectively, and the statistical analyses were significantly different (P < 0.05 - 0.01). PICKCa rabies vaccine and PICKCa hepatitis B vaccine are ongoing in phase-1 clinical trials in Singa-pore. Keywords PICKCa Adjuvant, Therapeutic Vaccines, Mechanisem of Action 皮卡佐剂及其治疗性疫苗作用机理 林海祥*，张译 北京依生兴业科技有限公司，北京 Email: *haixianglin510@https://www.360docs.net/doc/866692883.html, *通讯作者。
治疗性乙肝疫苗的研究现状
治疗性乙肝疫苗的研究现状 治疗性疫苗是近年发展起来的免疫治疗新概念，旨在打破机体的免疫耐受，提高机体特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。从发展趋势来看，乙肝病毒治疗性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染特别是慢性乙肝病毒携带者治疗研究领域的热点，它与现有抗乙肝病毒药物的联合应用，将成为一种新的治疗方法。 治疗性疫苗是近年发展起来的免疫治疗新概念，旨在打破机体的免疫耐受，提高机体特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。治疗性疫苗主要应用于病毒感染、肿瘤等疾病的治疗。治疗性乙肝疫苗的应用针对慢性乙肝患者或HBV携带者，通过不同途径呈递乙肝抗原，打破机体的免疫耐受，有效诱导免疫应答，达到清除乙肝病毒的目的。乙肝治疗性疫苗是治疗慢性乙肝的重要措施，本文就其研究进展作一综述。 治疗性疫苗分为三类：蛋白类疫苗、DNA疫苗、细胞疫苗，其中蛋白类疫苗包括亚单位疫苗、免疫复合物疫苗、多肽疫苗。 1 治疗性疫苗的研制 1.1 蛋白类疫苗 1.1.1 亚单位疫苗用于慢乙肝治疗的亚单位蛋白疫苗是通过基因工程方法生产的重组HBsAg，包含HBV包膜蛋白的不同组分(preS1、preS2、S)，并通过哺乳动物细胞及酵母菌系统表达。研究表明，应用Pre S2/S疫苗(GenHevac BR○，Pasteur Merieux)或S疫苗(RecombivaxR○，Merck)对CHB病人进行治疗，证实亚单位疫苗能够减低HBV的复制，但疗效仍有限。而Hepacare疫苗虽然有很强的免疫原性，能够降低免疫耐受儿童血清中病毒DNA 拷贝数，但不能有效清除肝细胞内cccDNA，治疗效果仍不理想。 1.1.2 免疫复合物型疫苗(immunogenic complex，IC)疫苗复旦大学医学院闻玉梅等构建了HBsAg加人抗HBS免疫球蛋白作为免疫原性复合物型治疗性疫苗，这种疫苗是通过改变对HBsAg的呈递方式以诱生有效的免疫，消除免疫耐受性。抗体能对抗原的免疫原性起到增强的作用，在于增加抗原被APC细胞捕获并加工处理，进而激活抗原特异性淋巴细胞，诱导发生免疫应答反应。应用IC对慢性乙肝患者进行治疗，结果表明，该Ic不仅能打破HBsAg转基因小鼠的耐受状态，且激发n1型应答(IFN一7及IL一12分泌增加)，使血清HBsAg转阴，初步显示了抗原一抗体复合物(Ic)的免疫治疗作用。此类疫苗也存在不足，即对细胞免疫应答的激发远高于对体液免疫应答的激发，因此需要进一步优化。 1.1.3 多肽疫苗由于蛋白质抗原不是通过完整的分子发挥作用的，抗原分子表位的研究是近年来新的研究趋势——有效的保护取决于一组表位的组合与搭配。通过对蛋白质抗原的B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位、NK细胞表位及MHC限制位等有利于免疫识别表位的深入研究，为设计新一代高效、高特异性疫苗奠定了基础。针对CTL表位的脂肽疫苗：此种疫苗的理论基础是基于抗原分子表位水平的研究。由于蛋白质抗原通过表位来体现其免疫特异性，有效的保护性免疫有赖于一组表位的搭配与组合。已知HBcAg中的多肽18 27是HLA A2组织相容性抗原，可被CTL识别而产生免疫应答。将其和Th细胞多肽表位(破伤风类毒素的T细胞表位肽，TT830 843)以及脂质分子共价结合后制成了Theradign HBV 疫苗，提高了CTL多肽的免疫原性，不仅能打破慢性乙肝患者体内T细胞耐受，激发特异性及CTL应答，并使受试者血清病毒DNA转阴或拷贝数降低。 1.2 核酸疫苗 DNA疫苗是20世纪90年代出现的新的疫苗形式，是一种含抗原基因的表达