新一代基因测序技术概述

• 全基因组小分子RNA(miRNA)的分析
传统的芯片技术在检测miRNA时面临序列短、高度同源等
难题，而新一代基因测序技术利用miRNA序列短及其本身高 通量的优势，能发现更多的miRNA。
Schulte等利用SOLID新一代基因测序技术对良性和恶性的 神经母细胞瘤中miRNA的表达进行测序，通过聚类分析提示：
• 38岁的美国女星Angelina Jolie在《纽约时报》上发表了
《我的医疗选择》一文，称由于自己携带有变异 BRCA1基
因，医生估计她患上乳腺癌的风险高达87%，患上卵巢癌的 风险高达50%，她母亲在56岁时死于癌症。朱莉说切除术后， 她患上乳腺癌的风险已降至5%。将来有与安吉丽娜•朱莉同 样担忧的女性就可以借助 NGS技术进行BRCA检测，提早 采取相关措施。
• 新一代基因测序技术可应用于肿瘤高发或家族性遗 传病人群，通过对这些人群进行全基因组检测，鉴 定出肿瘤相关基因异常后，可进行早期干预，通过 改变生活方式或定期检测来预防肿瘤发生，即使发 生肿瘤，也能早期诊断、早期治疗，从而改善预后， 延长病人生存期 。
• 通过新一代基因测序技术能鉴定出更多新的与肿瘤 相关的基因．且检测成本更低．更能在人群中广泛 普及．这为肿瘤的个体化基因治疗提供条件。
由于成本和测序数据输出量的限制，用Sanger测序法获取不同个体的 基因组进行大规模的对比研究是不可行的
从2004年起，一系列新的DNA测序技术，名为“新一代基因测序技术”， 不 断得到开发，在生物医学领域引发了许多突破性的发现，并彻底改变了基因组 测序领域的发展
自动化Sanger方法被认为是“第一代”基因测序技术 “新一代基因测序技术” (Next Generation Sequencing Technologies， NGS)
新一代基因测序技术的临床应用
• 自2010年以来，使用新一代测序仪的临床试验数量有大幅
度的增加。有全基因组测序，也有全外显子组测序，还有 RNA测序和定向测序（targeted sequencing）。不论采取 哪种测序方式，所有这些临床试验都是为了发现致病的遗传 异常，并且根据这些异常信息来指导临床诊疗工作。与此同 时，这些信息也有助于生物制药企业开发出更多的靶向治疗 药物，也可以帮助了解某些药物产生耐药性的原因。
近年来，Illumina公司在基因测序仪行业一直占据主
导地位，其产品占据60％市场份额。2010年推出的
IlluminaGA测序仪，HiSeq2000,就是一个标准高通量大 规模平行基因测序的典范。HiSeq2000一次测序耗时为 10天，能完成600亿个碱基对的测序，试剂成本仅为24
000美元。Illumina公司在2011年推出的测序仪，MiSeq，
Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止， 并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一 系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱 基序列。
诺贝尔奖得主Frederick Sanger和Walter Gilbert
平行测序。不同于传统方法将荧光素标记在核苷酸碱基上，
SMRT技术的核苷酸标记在磷酸链上，避免了染料基团干扰 DNA聚合酶的活性；一个核苷酸掺入后，DNA聚合酶切断
磷酸链，释放出染料分子，降低了干扰信号。这些技术保证
了PacBio RS能够进行单分子实时测序，读长在1 000 bp以 上，反应时间从30 min到1 d。
测序技术解决起这种问题来却毫不费力，能够以极快的速
度完成这一切。
肿瘤研究领域中的应用
• 全基因组测序
Parsons等利用新一代基因测序技术对22例多形性 胶质母细胞进行测序．新发现大部分年轻胶质瘤病人和复 发胶质瘤病人在IDH1位点上均频发突变。 Lin等用大规模平行测序法检测多形性胶质母细胞瘤 和正常脑组织的基因，在多形性胶质母细胞瘤中筛选出 4535个基因表达异常。 Lee等利用新一代基因测序技术对原发性肺癌和和相 邻正常组织的完整序列进行比较．发现超过5万个“点突 变”，其中530个得到确认：进一步观察发现激酶基因发 生氨基酸突变的概率较高。
NGS技术平台简介
• Roche(454)GS FLX基因测序技术
首先对目标DNA的酶切短链进行油包水PCR扩增，然
后以扩增的DNA酶切短链为模版来合成新的DNA。当对
应的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)被加入到新合成的DNA链 上时，添加的荧光素酶能产生光。根据闪光次序以及对 应加入的dNTP，测序仪所携带的软件就可以创建目标 DNA模板的具体序列信息。
• 基因的甲基化检测
基因的甲基化已经成为肿瘤分子生物学研究的热
点之一，利用改良的甲基化特异数字化核型分析法
能敏感测出全基因组的DNA甲基化位点，且具有高
通量、低成本的优势。
新一代基因测序技术在肿瘤研究中的发展 前景
• 新一代基因测序技术在肿瘤研究中处于起 始阶段，基本上局限于肿瘤的分子生物学 方面的研究，通过高通量大规模的检测肿 瘤细胞中基因组及RNA水平的变化来研究 肿瘤发生的相关机制。
共同特征 ：
1. 新一代基因测序技术都能够同时处理以百万计的基因序列读取，这也是它们能高 通量地测序基因的原因。 2. 新一代基因测序技术通过PCR扩增创建它们的基因序列读取片段库，劳动强度大大 低于传统的使用载体克隆的Sanger测序。 3. 与自动化Sanger测序技术相比，新一代基因测序技术所产生的读长都比较短(35— 700碱基)。
谢谢！
• Life Technologies公司／Ion Torrent PGM 测序平台
自然条件下，DNA聚合酶将1个核苷酸掺入DNA链中，就会 释放1个H+ ，该 H+ 所带电荷改变了溶液的pH值，可供离子
探头检测分析。
Ion Torrent测序又被标榜为第4代测序技术。 无需荧光物质标记和使用高清晰度摄像头，测序成本大幅 降低，能在2～3 h内完成。 模板读长较短是其缺点。
遗传病筛查领域
• 新一代测序技术对于新生儿孟德尔式遗传病筛查项目也很 有帮助。临床医生们通常都会根据表型与基因型的关系进 行单基因遗传检测，以此来明确诊断。不过孟德尔式遗传
病也能够以非常复杂的形式存在，同一种表型可能是由多
个基因来决定的，其中就有可能存在目前尚未被发现的基 因。在这种情况下单基因检测就显得无能为力了，新一代
•
Illumina的Genome Analyzer测序技术
对目标DNA的酶切短链进行扩增是通过桥式PCR来完成的。经过 PCR扩增后，芯片上的目标DNA片段簇被用来做为模版来合成新的 DNA链，四个差异化标记的荧光dNTP为每个目标DNA片段簇的复 制提供原料。一旦单个dNTP被加入新合成DNA的末端，此dNTP的 差异化标记荧光就会被读取并记录，由此实现边合成边测序。当 DNA延伸步骤完成，测序仪所携带的电脑软件程序就会分析每个目 标DNA簇的序列，并完成各个短链序列的对齐，以及目标基因组的 组合 。
2001年，完成了第一个人类基因组序列图谱。该基因组序列图谱 不仅可以帮助快速识别单个基因，而且为探索研究人类基因组的主 要区域提供了便利
Sanger测序法的局限性
对常规DNA测序来说太昂贵，太耗时。随着各种动植物基因组数据的 大量产生，科学家开始专注于基因的个体多样性，并尝试用新 的方法来描述个体的基因组
新一代基因测序技术原理及其
在医学中的应用
新一代基因测序技术(Next Generation
Sequencing Technologies)是一系列在2004年后 问世的新的DNA测序技术。这些新技术使用不同 以往的化学测序法，依靠高度并行的基因序列读
取方式，取得了令人难以置信的DNA测序高通量。
两者miRNA表达差异显著，两者miRNA的转录组也有显著差
异。
• 肿瘤全转录组分析
转录水平是调控肿瘤细胞增殖的重要方法。在肿瘤的发
生和转移中发挥重要作用。而利用新一代测序技术能高通量 地鉴定肿瘤细胞中转录组的变化，为肿瘤研究提供重要信息。
An等利用SOLID新一代基因测序技术对正常眼葡萄膜黑色素细胞和 眼葡萄膜黑色素瘤细胞中的全转录组进行检测，通过选择性对5155个已 注释的参与细胞通路、周期、凋亡和细胞黏附连接的基因进行详细分 析．鉴定出21个基因在正常眼葡萄膜黑色素细胞和眼葡萄膜黑色素瘤细 胞中表达有差异．这21个基因可能参与眼葡萄膜黑色素瘤的发生。
相对Sanger法，新一代基因测序技术的主要优点是能够快 速，低价地提供巨量的基因序列数据。它们每次测序运行能读 取的碱基数高达百亿。 可以代替生物晶片去对基因定性、定量分析。
可以快速测序全基因组，大规模对比研究不同个体的基因组 成为可能；
2004年起开始面世的一系列新的DNA测序技术有统一的名称—— “新一代基因测序技 术”。事实上不同，但是有3个
新一代基因测序技术能在数天内完成第一代基因
测序技术花费1O年完成的人类基因组测序。
自2004年问世起，不断发展的新一代基因测序
技术（NGS）在生物医学领域引发了许多突破性
的发现，推动了基因组学的革命，促进新学科的
创立，如个人基因组学，细菌基因组流行病学。
基因测序技术起源与发展 新一代基因测序技术平台简介 新一代基因测序技术的临床应用
肿瘤分子诊断领域
• BRCA是Breast Cancer Susceptibility Gene的缩写。BRCA
基因变异最早被发现与女性的乳腺癌和卵巢癌发病有密切的
关系。BRCA1和BRCA2属于抑癌基因，叫乳腺/卵巢肿瘤易 感基因。正常细胞中，BRCA1和BRCA2可以帮助DNA损伤 修复和维护DNA完整，防止癌细胞的产生。如果 BRCA1/2 产生基因变异，失去了这一保护，细胞产生癌变的几率大大 增加。而BRCA2基因变异与男性的乳腺癌，胰腺癌和前列 腺癌有密切关系。

肿瘤分子诊断领域
肿瘤研究领域
遗传病筛查领域 传染病研究领域 细菌基因组流行病领域
基因测序技术起源与发展
20世纪70年代初期，分别在几个独立的实验室，以不同的方法实 现了基因测序
直到1977年，可靠的基因测序方法——Sanger测序法和Maxam— Gilbert测序法才问世
Sanger测序法因为其试剂高效低毒，因而得到不断的改善，进一 步发展成依靠染色的自动化分析基因测序法
• Pacific BioSciences公司的PacBio RS测序仪
采用荧光素标记的dNTPs进行单分子实时测序，
又称为SMRT技术(single molecule，real-time)，因
此该公司的PacBio RS为第3代DNA测序仪。
• SMRT技术将DNA聚合酶固化在每个称为ZMW 的小池里， 仅照射ZMW 底部30 nm的区域，实时检测荧光素标记的4种 核苷酸掺入。利用其专有的SMRT 芯片(SMRT cel1)，内含 约75 000个ZMW，因此可以同时对近75 000个单分子进行
针对较小的实验室和临床诊断市场，其数据输出量小于
2010年推出的HiSeq200。
•
Biosystems SOLID 基因测序仪
该测序技术采用了独特的以四色荧光标记寡核苷酸的 连续连接反应为基础测序方法。具体操作也是开始于油 包水PCR扩增连接在微珠上的目标DNA酶切短链。扩增 后，用共价键把微珠及其扩增目标DNA短链连接到芯片 表面，然后放置到SOLID基因测序仪的缓冲液测试槽内 进行DNA测序。