分子生物学实验技术

分子生物学实验技术

目录

实验一细菌的培养 (2)

实验二质粒DNA的提取 (3)

实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (4)

实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (5)

实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (7)

实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (8)

实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (9)

实验八RNA提取与纯化 (11)

实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (13)

实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (15)

实验十一感受态细胞的制备及转化 (16)

实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (18)

实验十三DNA分析——Southern杂交 (19)

一基本操作

实验一、细菌培养

实验二、质粒DNA提取

实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度

实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析

实验八、植物RNA提取及纯化

二、目的基因获取

实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA

实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA

三、目的基因的克隆和表达

实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应

实验十一、感受态细胞的制备及转化

实验十二、克隆的筛选和快速鉴定

实验十三、DNA分析——Southern杂交

实验一细菌的培养

一、目的

学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理

在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器

（一）实验材料

大肠杆菌

（二）试剂

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化钠

4、1mol/L NaOH

5、琼脂粉

6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）

（三）仪器

1、培养皿

2、带帽试管

3、涂布器

4、灭菌锅

5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）

6、恒温摇床

四、操作步骤

（一）LB培养基的配制

配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：

细菌培养用胰蛋白胨10g

细菌培养用酵母提取物5g

NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。

LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。

（二）细菌的培养

（１）在液体培养基中培养

1、过夜培养

⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。

⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。

⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。

２、大体积培养

⑴按1∶100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。

⑵于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。

（２）在固体培养基中培养细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。平板划线法分离单菌落

⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。

⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。

⑶于37℃培养直至长出单菌落。

实验二质粒DNA的提取

目的

学习碱裂解法提取质粒的原理

原理

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

试剂与器材

一、试剂

1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5。高压灭菌20min。

2、LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20min。

3、溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。

4、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须现配）