遗传学实验 大肠杆菌抗药性突变株的分离

实验五报告大肠杆菌抗药性突变株的分离

PB12210261 徐导

中国科学技术大学生命科学学院

【摘要】

大肠杆菌有个体小、生活周期短、常能在简单的合成培养基上迅速繁殖等特点，并且可以在相同条件下处理大量个体，所以是进行遗传学研究的良好材料。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。

【关键词】

大肠杆菌抗药性培养基

【Abstract】

Escherichia coli is individual small, short life cycle, can often features multiply rapidly in synthetic medium and simple, and can handle a large number of individuals under the same conditions, so that it is a good material for genetic research. Microbial resistance mutations are changes in DNA molecules in a specific position caused by the structure, has nothing to do with the presence of drug, a drug exists only as a means of separating a resistant strain, rather than as a trigger induced mutation.

【Key words】

Escherichia coli Resistance Culture medium

【前言】

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系，是进行遗传学研究的良好材料。

【实验部分】

一、实验目的

1、熟悉基本微生物操作技术。

2、观察大肠杆菌的形态特征，学习油镜的使用。

3、学习用梯度平板法分离抗药性突变株。

4、了解微生物基因突变的特点。

二、实验原理

微生物遗传学是以病毒、细菌、小型真菌以及单细胞动植物等微生物为研究对象的遗传学分支学科。微生物有个体小、生活周期短、常能在简单的合成培养基上迅速繁殖等特点，并且可以在相同条件下处理大量个体，所以是进行遗传学研究的良好材料。微生物遗传学在20世纪40～50年代的发展，促进了遗传学中一些重要基本理论的阐明；50～60年代又极大的推动了分子遗传学的发展。基因中碱基顺序的改变可以导致微生物细胞的遗传变异。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。

为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验拟采用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板的方法是：先倒

入不含药物的底层培养基，把培养平板斜放，凝固后将平板平放，再倒入含有链霉素的上层培养基，这样便可得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板。在此平板上涂布大量敏感菌，经过培养后，在链霉素浓度比较高的部位长出的菌落中可分离到抗链霉素突变株。

梯度平板法

三、实验材料

1、菌株大肠杆菌：Strs

2、培养基 LB固体培养基

3、溶液或试剂链霉素（100 mg/mL）

4、仪器或其他用具：载玻片、盖玻片、胶头滴管、盛有70%乙醇的烧杯，1 ml 移液管(灭菌)，涂棒，烘箱，培养箱，灭菌锅等

四、实验步骤

1、接种大肠杆菌于盛有5 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养24 h。

2、在烘箱中溶化LB琼脂培养基。

3、倒10 ml 已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固。（图Ⅰ）

4、在已经凝固的平板低琼脂一边标示“10”，放回水平位置后，再在底层培养基上加入含有10 ug/ml链霉素的LB琼脂培养基10 ml。凝固后，便制得一个链霉素浓度从一端的0 ug/ml到另一端10 ug/ml的梯度平板。

5、倒20 ml无抗培养基于另一个培养皿，待其干燥后得到另一个无抗平板。（利用等待平板干燥的时间，去显微镜教室观察大肠杆菌形态）

6、用1 ml无菌吸管分别吸取 200 ul 大肠杆菌培养液加到梯度平板和无抗平板上，涂布。

7、待培养基表面干燥后，37℃倒置培养24 h。

8、观察无抗平板与梯度平板菌落分布的特征，对比两者的区别，分析抗药突变株菌落分布的特点。

【实验结果】

本次实验第一次倒平板失败，两个平板都没有菌落长成；第二次倒平板较成

功，有菌落生长，可以观察到许多密密麻麻的小白点，是一个大肠杆菌形成的菌落。

【思考与讨论】

第一次实验失败的原因在于涂布时，没有等到金属圈冷却到室温，导致大肠杆菌被烫死。第二次实验时，吸取到上次失败的经验，做得比较成功。倒平板时要胆大心细，认真仔细。

【总结与展望】

本实验通过做大肠杆菌抗药性突变株的分离，学会了倒平板的方法，积累了许多的倒平板的经验，掌握了梯度平板法。

【参考文献】

章名春;抗生素产生菌诱变育种[J];遗传;1980年05期