蛋白提取常见问题分析

蛋白提取常见问题分析

Q：如何进行组织液氮研磨？

A：将组织块在液氮里冻实，敲成大小合适的小块后放在研钵里，倒液氮，边研边加，保持研钵里有液氮，或是保持组织块不融。研碎了就行了。注意做前研钵等器具要预冷，用液氮或是先放负二十冰箱一段时间。

注意事项：1.液氮研磨的研钵，药勺必须预冷。2.开始研磨前，将研钵置于冰袋上，并加入少量的液氮，快速将样品转入其中。3.继续加入液氮，快速捣碎样品，然后快速研磨。4.待液氮挥发完前，继续加入液氮，快速淹没，重复操作，待样品变成非常细小的白色干粉时即可。5.将干粉刮下转入裂解液中，再加裂解液于研钵中，将其中的黏附的样品洗下。整个过程保持样品处于温度低的环境，研磨的速度要快而有力度。这样才能破碎细胞，同时不降解蛋白。

Q：提取蛋白Western内参如何选择？

A：参照下表选择：

适用范围 内参名称 分子量大小 注意事项

胞浆蛋白和总蛋白 beta-actin 43 kDa 不适用于骨骼肌样品，细胞

生长条件的改变和细胞外

基质成分的相互作用可能

会改变肌动蛋白的合成

胞浆蛋白和总蛋白 GAPDH 30-40 kDa 一些生理因素例如缺氧症

和糖尿病会增强 GAPDH 在

特定细胞中的表达

胞浆蛋白和总蛋白 Tubulin 微管蛋白 55 kDa 微管蛋白的表达随着抗菌

和抗有丝分裂抗性药物而

改变

核蛋白 TBP（TATA box binding protein）38 kDa 不适用于除去 DNA 的样本 核蛋白 Lamin A74 kDa

核蛋白 Lamin B核纤层蛋白72 kDa 不适用于除去核膜的样本 核蛋白 Histon H3

膜蛋白 α-Tubulin55 kDa

膜蛋白 Na-K ATPase

植物内参 Rubisco核酮糖二磷酸羧化酶

Lhcb4多抗

当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H)，或者核纤层蛋白(nuclear lamina protein)等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，

在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。反之，组蛋白Histone H2A.X 及Histone H3.1等由于是染色体的组成型表达组分，表达比较稳定，经常被作为最广泛的核内参使用。

Q：膜蛋白不溶于loading buffer，或者煮沸后形成沉淀怎么办？

A：用60度变性1h；如果还是不行，把loading buffer的SDS换成LDS。

Q：多少细胞提的蛋白够做western blot？

A：一般5×106足够。但要看是哪种细胞，有的细胞的体积就很小，而有的细胞则铺得很开。常规做WB一个孔道上样要105个细胞。但也和目的蛋白及提取的方式有关。如果是膜蛋白或是某细胞器内分布的蛋白细胞数得增多。

Q：同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？

A：可以，甚至可以同时测十几种样品。

Q：蛋白提取后可以存放多久？

A：－80℃，一年没有问题。关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌污染

Q：提取蛋白后做WB一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？A：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

Q：做组织样品蛋白的western的时候，提取蛋白有什么特别注意的吗？

A：必须进行研磨、匀浆处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail）。

Q：蛋白电泳胶浓度如何选择？

A：参照下表选择胶浓度

蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)

<104 20-30

1×104-4×104 15-20

4×104-1×105 10-15

1×105-5×105 5-10

>5×105 2-5

Q：提取的蛋白选用何种方法定量？

A：提取的样品中若含有去垢剂则需要选用BCA法进行蛋白浓度测定，若样品中含有螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类等，则需要选用Bradford法进行蛋白浓度测定。

Q：用组蛋白H3作为核蛋白的内参,结果没出现条带，目的蛋白有条带？

A：组蛋白与DNA结合紧密,需进行超声剪切DNA,不然得到的信号很弱。

可以试试将常规所取上清留下的沉淀用loading buffer重悬,然后用超声剪切试试,上样对比一下,组蛋白应该在沉淀中。

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