微生物发酵制药宝典-第十章(2)制药微生物菌种建立
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菌株1
生产菌种的建立
菌株2
用去壁酶处理将微生Байду номын сангаас物细胞壁除去，制成 原生质体。
e.高产菌株
去细胞壁
原生质体1
b.原生质体融合： c.细胞壁再生
原生质体2
高渗，PEG处 理
d.筛选，鉴定 异核体或重组子
hybrid cell
杂合原生质体
发酵制药 10.3.1.5基因组shuffling
生产菌种的建立
概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质 体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选
突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，
即经济适用的菌种。 特点：短时、快速，定向 应用：效果很显著
发酵制药 基因组Shuffling过程
生产菌种的建立
• 突变：随机突变获得单个性状优良的菌株 • 重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再 生，形成第一个融合库（F1） • 筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株 • 多轮循环：再次融合，得到融合库F2、F3、 F4……., 筛选鉴定…… • 结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种
发酵制药 10.3.1.1 自然分离
生产菌种的建立
• 目的：出发菌的获取 • 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 • 预处理：根据分离目的和微生物的特性。 温度；化学处理；离心、膜过滤 • 培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。 • 分离方法： （1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液 （2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。 • 培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃， 45－50℃；7－14天至1月。
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.2 生产选育
• 概念：不经过人工诱变处理，根据菌种 的自然突变而进行的菌种筛选过程。 • 应用： （1）菌种的提纯复壮。（2）防 止退化，稳定生产水平。1年1次。 • 过程 菌 种 单孢 子 平板 分离 单菌落 测活 优良 菌株
效率低（10－E5－E8），增产幅度小
发酵制药
生产菌种的建立
药物的筛选
• 琼脂扩散法——活性测定： 非致病菌为对象，筛选生物活性物质。 耐药和超敏菌种。 HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。 • 靶向筛选 • 高通量筛选 • 高内涵筛选
发酵制药
生产菌种的建立
微生物药物与菌种的筛选流程
样品采集
微生物分离
筛选方法学建立
培养
筛选鉴定 新 药 前药－新 化合物分离 研 阳性结果 化合物 纯化鉴定 究 与 开 生产出发菌 菌种鉴定与保藏 发
发酵制药 10.3.1.3 诱变育种
生产菌种的建立
• 概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种 发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。 • 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 • 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 • 生物类：噬菌体，转座子。
特点：快速，简单，效益大。
缺点：无定向性，大量筛选。
1.0
0.8
OD
0.6 0.4 0.2 0.0 0. 5. 10. 15. Hours 20. 25. 30.
发酵制药 生产菌种的建立 例3：提高泰乐菌素生产能力
突变育种 基因组shuffling 效果
出发菌种
Zhang YX, et al., Nature, 415(6872):644-666.
发酵制药
生产菌种的建立
10.3 制药微菌种的建立
• 10.3.1 新药生产菌种的选育 • 10.3.2 菌种保藏 • 10.3.3 菌种库建立与质量控制
制药生产对菌种的要求
• 1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种， 无杂菌及噬菌体。 • 2.易生长性：生长旺盛、迅速； • 4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。 • 3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 • 4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。 • 5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。 菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进 质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用
发酵制药
生产菌种的建立
120 units
例1：改良青霉菌 生产青霉素的产量
随机突变育种 方法： • X-射线(X) • 紫外线(UV) • 氮芥(N)
2658 units
发酵制药
E. coli -80 ℃ INV a F' stock CK 0.5
生产菌种的建立
0.5ml 0.5ml
例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）
制药工艺学
Pharmaceutical Technology
主讲教师：元英进 教授
天津大学化工学院制药工程系
第二篇 生物技术制药工艺
第十章 微生物发酵制药工艺
10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 概述 微生物生长与生产的关系 制药微生物菌种建立 制药微生物培养基制备 灭菌工艺 微生物发酵培养技术 发酵工艺过程的检测与控制
发酵制药
生产菌种的建立
诱变方案设计
• 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。 • 诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。 中等剂量（80％致死率）。 • 选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。 措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产 物浓度。
发酵制药
生产菌种的建立
诱变育种流程
出发菌种 单孢子悬液 诱变处理
toothpick
-80℃ stock
1 菌落
1 菌落
0.5 ml
-80℃ stock
toothpick
1.0
1.0
1.25
1.25
2 菌落
10 菌落
10 菌落
1.25
1.5
1.5
2.0
2.0
2.5
2.5
发酵制药
生产菌种的建立
生长曲线(选择压2.5M)
1.4
1.2
黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5 绿色：耐1.25;红色：耐2.5
高产菌株 复筛
单菌落初筛 稳定性 特性 放大 中试
稀释涂板
投入生产
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.4 原生质体融合育种
•概念 通过化学或物理学的方法，使两个不同种 类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞， 产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。 特点：有一定的定向性，效果显著。
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备：
发酵制药
生产菌种的建立
1年，24,000 次分析
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.2 菌种保藏
从而丧失生产能力甚至菌株死亡。
•目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存
•原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，
生产菌种的建立
菌株2
用去壁酶处理将微生Байду номын сангаас物细胞壁除去，制成 原生质体。
e.高产菌株
去细胞壁
原生质体1
b.原生质体融合： c.细胞壁再生
原生质体2
高渗，PEG处 理
d.筛选，鉴定 异核体或重组子
hybrid cell
杂合原生质体
发酵制药 10.3.1.5基因组shuffling
生产菌种的建立
概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质 体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选
突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，
即经济适用的菌种。 特点：短时、快速，定向 应用：效果很显著
发酵制药 基因组Shuffling过程
生产菌种的建立
• 突变：随机突变获得单个性状优良的菌株 • 重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再 生，形成第一个融合库（F1） • 筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株 • 多轮循环：再次融合，得到融合库F2、F3、 F4……., 筛选鉴定…… • 结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种
发酵制药 10.3.1.1 自然分离
生产菌种的建立
• 目的：出发菌的获取 • 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 • 预处理：根据分离目的和微生物的特性。 温度；化学处理；离心、膜过滤 • 培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。 • 分离方法： （1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液 （2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。 • 培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃， 45－50℃；7－14天至1月。
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.2 生产选育
• 概念：不经过人工诱变处理，根据菌种 的自然突变而进行的菌种筛选过程。 • 应用： （1）菌种的提纯复壮。（2）防 止退化，稳定生产水平。1年1次。 • 过程 菌 种 单孢 子 平板 分离 单菌落 测活 优良 菌株
效率低（10－E5－E8），增产幅度小
发酵制药
生产菌种的建立
药物的筛选
• 琼脂扩散法——活性测定： 非致病菌为对象，筛选生物活性物质。 耐药和超敏菌种。 HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。 • 靶向筛选 • 高通量筛选 • 高内涵筛选
发酵制药
生产菌种的建立
微生物药物与菌种的筛选流程
样品采集
微生物分离
筛选方法学建立
培养
筛选鉴定 新 药 前药－新 化合物分离 研 阳性结果 化合物 纯化鉴定 究 与 开 生产出发菌 菌种鉴定与保藏 发
发酵制药 10.3.1.3 诱变育种
生产菌种的建立
• 概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种 发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。 • 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 • 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 • 生物类：噬菌体，转座子。
特点：快速，简单，效益大。
缺点：无定向性，大量筛选。
1.0
0.8
OD
0.6 0.4 0.2 0.0 0. 5. 10. 15. Hours 20. 25. 30.
发酵制药 生产菌种的建立 例3：提高泰乐菌素生产能力
突变育种 基因组shuffling 效果
出发菌种
Zhang YX, et al., Nature, 415(6872):644-666.
发酵制药
生产菌种的建立
10.3 制药微菌种的建立
• 10.3.1 新药生产菌种的选育 • 10.3.2 菌种保藏 • 10.3.3 菌种库建立与质量控制
制药生产对菌种的要求
• 1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种， 无杂菌及噬菌体。 • 2.易生长性：生长旺盛、迅速； • 4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。 • 3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 • 4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。 • 5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。 菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进 质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用
发酵制药
生产菌种的建立
120 units
例1：改良青霉菌 生产青霉素的产量
随机突变育种 方法： • X-射线(X) • 紫外线(UV) • 氮芥(N)
2658 units
发酵制药
E. coli -80 ℃ INV a F' stock CK 0.5
生产菌种的建立
0.5ml 0.5ml
例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）
制药工艺学
Pharmaceutical Technology
主讲教师：元英进 教授
天津大学化工学院制药工程系
第二篇 生物技术制药工艺
第十章 微生物发酵制药工艺
10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 概述 微生物生长与生产的关系 制药微生物菌种建立 制药微生物培养基制备 灭菌工艺 微生物发酵培养技术 发酵工艺过程的检测与控制
发酵制药
生产菌种的建立
诱变方案设计
• 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。 • 诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。 中等剂量（80％致死率）。 • 选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。 措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产 物浓度。
发酵制药
生产菌种的建立
诱变育种流程
出发菌种 单孢子悬液 诱变处理
toothpick
-80℃ stock
1 菌落
1 菌落
0.5 ml
-80℃ stock
toothpick
1.0
1.0
1.25
1.25
2 菌落
10 菌落
10 菌落
1.25
1.5
1.5
2.0
2.0
2.5
2.5
发酵制药
生产菌种的建立
生长曲线(选择压2.5M)
1.4
1.2
黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5 绿色：耐1.25;红色：耐2.5
高产菌株 复筛
单菌落初筛 稳定性 特性 放大 中试
稀释涂板
投入生产
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.4 原生质体融合育种
•概念 通过化学或物理学的方法，使两个不同种 类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞， 产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。 特点：有一定的定向性，效果显著。
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备：
发酵制药
生产菌种的建立
1年，24,000 次分析
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.2 菌种保藏
从而丧失生产能力甚至菌株死亡。
•目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存
•原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，