微生物发酵制药宝典-第十章(2)制药微生物菌种建立
合集下载
微生物发酵制药29页PPT
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
微生物发酵制药
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
Thank you
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
微生物发酵制药
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
Thank you
微生物发酵制药(下)
发酵制药
培养技术
4．连续式操作
概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程中， 不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的 发酵液，直至发酵结束。 特点： 恒定状态的发酵，发酵罐内体积及其物系的组成将不 随时间而变。 培养基连续稳定流加；产物连续稳定收获；提高菌体 密度；自动化。 缺点：时间长，杂菌污染、突变机会增多。
第二章 微生物发酵制药工艺
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 微生物发酵与制药 微生物生长与生产的关系 制药微生物生产菌种建立 培养基制备 灭菌工艺
2.5
灭菌工艺
灭菌方法与原理 培养基灭菌工艺 空气除菌工艺
发酵制药
灭菌工艺
几个概念
杂菌：除生产菌以外的任何微生物。 污染：感染杂菌的培养或发酵体系。 消毒：杀灭或清除病原微生物，达到无害化 程度，杀灭率99.9%以上。 杀菌：杀灭或清除一切微生物，达到无活微 生物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。 灭菌：微生物杀灭率99.999999%以上。
发酵制药
培养技术
5、灌流（注）式操作
概念：培养液一起装入发酵罐，接种后培 养过程中，不断补充新培养基，取出部分条 件培养基，菌体仍然滞留罐内。 特点： 除去有毒害的代谢物 补充营养物质
发酵制药
培养技术
小结
发酵培养的基本过程 培养技术:概念与特点 操作方式：区别，特点
发酵制药
培养技术
思考题
（1）如何种子罐级数确定？ （2）深层培养、固定化培养、高密度培养有何 特点？ （2）各种操作方式的异同点，如何选择应用？
发酵制药
培养技术
2.6.3 发酵培养的操作方式
1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作 2、流加式操作，补料－分批式操作 3、半连续式操作，反复分批式或换液培养 4、连续式操作，衡态操作 5、灌流式操作
第二章发酵工业微生物菌种制备与培养基
生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此 交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受 环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或 呈分散生长，或呈菌丝团状生长。
工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红 曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品： 酶制剂（enzyme preparation）、抗生素 (antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素 （steroid hormone） 等。
5、 担子菌（Basidiomycetes ）：所谓的担 子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物 。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视 ，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药 物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇 的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的 “1，2-β-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗 癌作用。
4、 放线菌(Actinomycetes)
放线菌因菌落呈防线状而得名。它是一个原 核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有 机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数 寄生。 放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌 丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉浸 培养（submerged cultures）中。其生长方式是 菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成 为菌丝体。菌丝长度既受遗传性的控制，又与环 境相关。
保存方法：
应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同 时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保 存方法，以便长期保藏。 酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封 保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。
微生物发酵制药
• 到19世纪末，L.Pasteur．P.Enrich和Von Rehiring等 陆续发明了预防或治疗各种细菌性传染性疾病的疫苗和 类毒素等。
• 此后，利用微生物生产疫苗的研究获得了蓬勃的发展。
• 1928年Fleming偶然发现了青霉素，但当时人们 认为动物试验结果不能指导人的医学实践。
• 直到l0年后，才打破了这个框框，通过动物试 验，把青霉素从细菌学家的好奇物质转变为医学 上具有活力的物质。
• 成品检验：包括性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热 源试验、无菌试验、酸碱度试验、效价测定、水分测定等。
• 成品包装：合格成品进行包装，为原料药。制剂由制剂车长与产物生成偶联型（coupling model），
菌体的生长与产物生成直接关联，生长期与生产期 是一致的。产物往往是初级代谢的直接产物。
• 随着细胞融合技术和基因工程的问世，为 微生物制药来源菌的获得提供了一种有效 的手段。工程菌和融合子经发酵后能生产 原来微生物所不能产生的药物或提高生产 效率。同时近年来发酵工艺及其控制方面 的研究也得到了发展，利用计算机在线控 制以及固定化细胞技术为微生物发酵制药 工业带来了新的发展空间。
• 我国微生物发酵制药工业起步较晚，建国后，在发 展原料药为主的方针指导下，于1953年5月l日在上 海第三制药厂正式投产了青霉素，1958年建设了以 生产抗生素为主的华北制药厂，投产了青霉素、链 霉素、土霉素和红霉素等品种、随着全国陆续建立 起—批微生物发酵药厂，在1957午我国开始了氨基 酸发酵的研究，其中谷氨酸的发酵于1964年获得了 成功，并投入生产。
• （2）糖类 主要有氨基糖、糖胺、核糖、环多醇和氨 基环多醇等，形成抗生素有氨基糖苷类抗 生素，如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、 潮霉素等。它们的共同前体是葡萄糖 ，合
• 此后，利用微生物生产疫苗的研究获得了蓬勃的发展。
• 1928年Fleming偶然发现了青霉素，但当时人们 认为动物试验结果不能指导人的医学实践。
• 直到l0年后，才打破了这个框框，通过动物试 验，把青霉素从细菌学家的好奇物质转变为医学 上具有活力的物质。
• 成品检验：包括性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热 源试验、无菌试验、酸碱度试验、效价测定、水分测定等。
• 成品包装：合格成品进行包装，为原料药。制剂由制剂车长与产物生成偶联型（coupling model），
菌体的生长与产物生成直接关联，生长期与生产期 是一致的。产物往往是初级代谢的直接产物。
• 随着细胞融合技术和基因工程的问世，为 微生物制药来源菌的获得提供了一种有效 的手段。工程菌和融合子经发酵后能生产 原来微生物所不能产生的药物或提高生产 效率。同时近年来发酵工艺及其控制方面 的研究也得到了发展，利用计算机在线控 制以及固定化细胞技术为微生物发酵制药 工业带来了新的发展空间。
• 我国微生物发酵制药工业起步较晚，建国后，在发 展原料药为主的方针指导下，于1953年5月l日在上 海第三制药厂正式投产了青霉素，1958年建设了以 生产抗生素为主的华北制药厂，投产了青霉素、链 霉素、土霉素和红霉素等品种、随着全国陆续建立 起—批微生物发酵药厂，在1957午我国开始了氨基 酸发酵的研究，其中谷氨酸的发酵于1964年获得了 成功，并投入生产。
• （2）糖类 主要有氨基糖、糖胺、核糖、环多醇和氨 基环多醇等，形成抗生素有氨基糖苷类抗 生素，如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、 潮霉素等。它们的共同前体是葡萄糖 ，合
3制药微生物培养基制备
链霉素 红霉素 柱晶白霉素 核黄素 类胡萝卜素 维生素B12 L－异亮氨酸 L－丝氨酸 L－色氨酸
发酵制药
培养基制备
氨基酸 丝氨酸 色氨酸 色氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸
氨基酸发酵的前体物质
菌体
前体物质
嗜甘油棒状杆菌 甘氨酸
异常汉逊酵母 氨茴酸
麦角菌
吲哚
脱氢极毛杆菌 2-羟基4-甲基硫代丁醇
作用：营养作用；环境条件（渗透压、pH等）； 稳定工艺控制（非营养成分，前体，促进剂， 消沫剂）。
• 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生 物生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。
发酵制药
2.4.1 培养基的成分
碳源 氮源 无机盐 水 生长因子 前体与促进剂 消泡剂
培养基制备
发酵制药
1、碳源
发酵制药
培养基制备
2、种子培养基－要求与质量控制
培养基成分必需完全，营养丰富。
用速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等物质， 但浓度不宜高。
种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近， 不能差异太大。
缩短发酵的延滞期。
发酵制药
3、发酵培养基
培养基制备
•概念： 提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基。
发酵制药
培养基制备
3、理论计算与定量配制
• 微生物生长和生产可用下列表达式表示：
碳源和能源＋氮源＋其他营养物质→细胞＋产物 ＋CO2＋H2O＋热量
• 单位细胞生物量所需最小的营养物质: • 单位产量的最小底物浓度:
发酵制药
培养基制备
碳源和氮源进行转化率计算和分析
•初步计算：参考微生物的化学和元素组成。 •转化率：单位质量原料生产的产物量或细胞量。 •理论转化率：根据代谢途径的物料衡算 •实际转化率：发酵过程中实际测量数值计算。 •目标：使实际转化率靠近理论转化率。
发酵制药
培养基制备
氨基酸 丝氨酸 色氨酸 色氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸
氨基酸发酵的前体物质
菌体
前体物质
嗜甘油棒状杆菌 甘氨酸
异常汉逊酵母 氨茴酸
麦角菌
吲哚
脱氢极毛杆菌 2-羟基4-甲基硫代丁醇
作用：营养作用；环境条件（渗透压、pH等）； 稳定工艺控制（非营养成分，前体，促进剂， 消沫剂）。
• 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生 物生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。
发酵制药
2.4.1 培养基的成分
碳源 氮源 无机盐 水 生长因子 前体与促进剂 消泡剂
培养基制备
发酵制药
1、碳源
发酵制药
培养基制备
2、种子培养基－要求与质量控制
培养基成分必需完全，营养丰富。
用速效性、容易被利用的碳、氮源和无机盐等物质， 但浓度不宜高。
种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近， 不能差异太大。
缩短发酵的延滞期。
发酵制药
3、发酵培养基
培养基制备
•概念： 提供微生物生长、目标产物生成的生产用培养基。
发酵制药
培养基制备
3、理论计算与定量配制
• 微生物生长和生产可用下列表达式表示：
碳源和能源＋氮源＋其他营养物质→细胞＋产物 ＋CO2＋H2O＋热量
• 单位细胞生物量所需最小的营养物质: • 单位产量的最小底物浓度:
发酵制药
培养基制备
碳源和氮源进行转化率计算和分析
•初步计算：参考微生物的化学和元素组成。 •转化率：单位质量原料生产的产物量或细胞量。 •理论转化率：根据代谢途径的物料衡算 •实际转化率：发酵过程中实际测量数值计算。 •目标：使实际转化率靠近理论转化率。
微生物发酵制药宝典 ppt课件
• 选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。 措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产 物浓度。
微生物发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
生产菌种的建立
诱变育种流程
出发菌种 单孢子悬液
诱变处理
高产菌株
单菌落初筛
稀释涂板
复筛
稳定性 特性
放大 中试
微生物发酵制药宝典 ppt课件
投入生产
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.4 原生质体融合育种
•概念
通过化学或物理学的方法，使两个不同种 类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞， 产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。
特点：有一定的定向性，效果显著。
微生物发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备：
用去壁酶处理将微生 物细胞壁除去，制成 原生质体。
• 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 • 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 • 生物类：噬菌体，转座子。
❖特点：快速，简单，效益大。 ❖缺点：无定向性，大量筛选。
微生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
生产菌种的建立
诱变方案设计
• 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。
• 诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。 中等剂量（80％致死率）。
微生物发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.1 自然分离
• 目的：出发菌的获取 • 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 • 预处理：根据分离目的和微生物的特性。
温度；化学处理；离心、膜过滤 • 培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。 • 分离方法： （1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液 （2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。 • 培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃，
微生物发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
生产菌种的建立
诱变育种流程
出发菌种 单孢子悬液
诱变处理
高产菌株
单菌落初筛
稀释涂板
复筛
稳定性 特性
放大 中试
微生物发酵制药宝典 ppt课件
投入生产
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.4 原生质体融合育种
•概念
通过化学或物理学的方法，使两个不同种 类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞， 产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。
特点：有一定的定向性，效果显著。
微生物发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备：
用去壁酶处理将微生 物细胞壁除去，制成 原生质体。
• 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 • 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 • 生物类：噬菌体，转座子。
❖特点：快速，简单，效益大。 ❖缺点：无定向性，大量筛选。
微生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
生产菌种的建立
诱变方案设计
• 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。
• 诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。 中等剂量（80％致死率）。
微生物发酵制药宝典 ppt课件
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.1 自然分离
• 目的：出发菌的获取 • 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 • 预处理：根据分离目的和微生物的特性。
温度；化学处理；离心、膜过滤 • 培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。 • 分离方法： （1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液 （2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。 • 培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃，
微生物发酵制药
作用机制
化学结构
细菌 真菌 放线菌
抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂
抑制细胞壁合成药 影响细胞膜功能药 干扰蛋白质合成药 抑制核酸合成药 抑制生物能量反应药
抗生素 维生素 氨基酸 核苷酸 甾体激素 酶及酶抑制剂
发酵工程制药的特点
• 微生物菌种选育获得高产 • 发酵的理论产量存在约10%的变量 • 发酵过程常温常压，操作条件温和 • 纯种培养、无菌条件 • 生产过程是以生物体的自动调节方式进行的 • 分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段 • 投资少、见效快
发酵罐的类型 • 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统 • 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium） 培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂
培养基的类型 • 按组成 • 按状态 • 按用途
培养基灭菌 • 空罐灭菌 • 实罐灭菌 • 连续灭菌
• 发酵热
pH • 补加酸或碱和补料的方式
溶氧和CO2 • 溶氧异常下降 • 溶氧异常上升 ➢ 措施
泡沫 • 负面影响 • 措施
染菌 • 发酵前期染菌 • 发酵后期染菌
发酵终点的判断 • 提高产物的产量和经济效益 • 降低生产成本
➢ 主要指标与中间分析项目雷同
菌体浓度 • 在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓
度成正比关系。特别是初级代谢产物。 • 菌体浓度过低，产物产率下降。 • 菌体浓度过高，产生其他影响。 • 措施：调节培养基中的营养物质的浓度。
营养物质 • 碳源 • 氮源 • 磷酸盐：生长亚适量浓度 • 补料：半饥饿状态
温度 • 考虑菌种及生长阶段 • 综合考虑其他培养条件 • 考虑菌种生长情况
制药工艺学--微生物发酵制药工艺 ppt课件
ppt课件
24/207
4、真实的生物学过程模拟与举例
tL：延滞期； tmax:最大比速率期
ppt课件
25/207
一种芽孢杆菌的生长曲线
ppt课件
26/207
Vero细胞在16％血清中生长曲线
ppt课件
27/207
5、生长与生产关系的模型
Gaden把生长与生产分为三种： I型：生长与生产偶联型 II型：生长与生产半偶联型 III型：生长与生产非偶联型
Monod方程：
μmax
μ =μmax S/(Ks + S)
比
生
S很低，浓度与比生长 长
速率成正比。
速 率
1/2μmax
S很高，菌体以最大比
生长速率进行生长。
Ks
基质浓度
μmax：各种基质对菌体的生长效率，不同基质之间比较。
Ks：为饱和常数，菌体对基质亲和力，Ks越小，亲和力越大，利用越好。
注意：与酶反ppt课应件 动力学MM方程的区别。
2发酵制药基本工艺过程9207菌种选育种子制备发酵培养分离纯化产品菌种选育发酵工段种子制备菌种活化发酵控制实验室种子库发酵车间10207原料药包装成品检验提炼工段预处理分离提取浓缩纯化成品工段包装车间提炼车间发酵制药过程工段岗位操作与车间流程关系库存间162微生物的生长与生产的关系微生物动力学研究微生物生长动力学11207基质利用的动力学生长与生产关系的动力学模型微生物发酵过程特征1发酵动力学研究概念
围。
ppt课件
13/207
发酵制药
已建立动力学模型的类型
发酵的反应过程与速度：
r S（底物） ─→ X（菌体） ＋ P（产物）
机制模型：根据反应机制建立，几乎没有 现象模型：经验模型，目前大多数
10微生物发酵制药工艺1幻灯片
成品工段
提炼车间
包装车间
包装
原料药
10.2 微生物的生长特征
1、微生物发酵基本过程特征/菌体生长与产物生成的特
征，三个阶段
❖
❖
❖
❖
❖
❖
发酵前期(fermentation prophase)
菌体生长期
发酵中期(fermentation metaphase)
产物合成（分泌）期
发酵后期(fermentation anaphase)
量没有明显增加的一段时间。延迟期是菌体适应环境的过程。
延迟期时间长短不一，与遗传和环境因素有关，由菌体与环
境相互作用的程度决定的。因不同接种量、不同菌种和菌龄
等而表现不同。工业上希望延迟期越短越好，常采用如种子
罐与发酵罐培养基尽量接近，对数期的菌体作为种子、加大
接种量等方法进行放大培养和发酵生产。
14
初级代谢与产物形成是完全分开的，如抗生素、生物碱、微生物毒素的
发酵。对于诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录
和产物表达，所以产物生成速率和比速率分别为：
比
生
长
或
比
生
长
速
率
p
生
物
量
或
产
量
时间t
时间t
5、代谢产物的生物合成
❖
代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。
有代谢不稳定性。
(2)次级代谢产物的构建单位
❖
微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由
碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳
（C2）化合物和初级代谢产物合成。
提炼车间
包装车间
包装
原料药
10.2 微生物的生长特征
1、微生物发酵基本过程特征/菌体生长与产物生成的特
征，三个阶段
❖
❖
❖
❖
❖
❖
发酵前期(fermentation prophase)
菌体生长期
发酵中期(fermentation metaphase)
产物合成（分泌）期
发酵后期(fermentation anaphase)
量没有明显增加的一段时间。延迟期是菌体适应环境的过程。
延迟期时间长短不一，与遗传和环境因素有关，由菌体与环
境相互作用的程度决定的。因不同接种量、不同菌种和菌龄
等而表现不同。工业上希望延迟期越短越好，常采用如种子
罐与发酵罐培养基尽量接近，对数期的菌体作为种子、加大
接种量等方法进行放大培养和发酵生产。
14
初级代谢与产物形成是完全分开的，如抗生素、生物碱、微生物毒素的
发酵。对于诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录
和产物表达，所以产物生成速率和比速率分别为：
比
生
长
或
比
生
长
速
率
p
生
物
量
或
产
量
时间t
时间t
5、代谢产物的生物合成
❖
代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。
有代谢不稳定性。
(2)次级代谢产物的构建单位
❖
微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由
碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳
（C2）化合物和初级代谢产物合成。
微生物药物的发酵工艺详解演示文稿
工业微生物大都为好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。
工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同 时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。
反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递 速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。
类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐
微生物药物的发酵工艺 详解演示文稿
第1页，共96页。
（优选）微生物药物的 发酵工艺
第2页，共96页。
（一）微生物药物工业生产菌种
工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但 要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追 求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽 可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。
第12页，共96页。
发酵生长曲线
平台期
对数期
衰亡期
迟滞期
发酵周期
生长期
生产期
次生代谢发酵原理：
当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率 下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢 物。以取得环境竞争优势，保存自身。
第13页，共96页。
影响发酵的相关因素—培养基
在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、 复壮和改良。
第3页，共96页。
工业生产菌株应满足的要求：
✓能够产生较高浓度的目标产物； ✓微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物； ✓产物便于分离提取； ✓能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物 质等； ✓不致病，不产生内毒素； ✓发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态， 即发酵条件较温和； ✓容易进行代谢调控。
试管/茄子瓶斜面 麸皮/米孢子培养物
工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同 时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。
反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递 速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。
类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐
微生物药物的发酵工艺 详解演示文稿
第1页，共96页。
（优选）微生物药物的 发酵工艺
第2页，共96页。
（一）微生物药物工业生产菌种
工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但 要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追 求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽 可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。
第12页，共96页。
发酵生长曲线
平台期
对数期
衰亡期
迟滞期
发酵周期
生长期
生产期
次生代谢发酵原理：
当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率 下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢 物。以取得环境竞争优势，保存自身。
第13页，共96页。
影响发酵的相关因素—培养基
在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、 复壮和改良。
第3页，共96页。
工业生产菌株应满足的要求：
✓能够产生较高浓度的目标产物； ✓微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物； ✓产物便于分离提取； ✓能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物 质等； ✓不致病，不产生内毒素； ✓发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态， 即发酵条件较温和； ✓容易进行代谢调控。
试管/茄子瓶斜面 麸皮/米孢子培养物
微生物药物的发酵生产技术
青霉素的产生菌——产黄青霉（Penicillium chrysogenum）51-20和点青霉（P. notatum），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到60000U/ml。
In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA’s Center for Drug Evaluation and Research.
pH的影响和控制：
青霉素发酵的最适pH一般认为是，应尽量避免pH超过7.0。 当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ； 当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。 可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。
青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。 0-56 h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。
发酵的影响因素及控制
碳源、氮源的影响和控制：
In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA’s Center for Drug Evaluation and Research.
pH的影响和控制：
青霉素发酵的最适pH一般认为是，应尽量避免pH超过7.0。 当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ； 当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。 可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。
青霉菌生长的适宜温度是30℃，分泌青霉素的适宜温度是20℃，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。 0-56 h维持在27.2℃，然后恒速降温至18.7℃，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2℃培养。这样变温培养法可比常温25℃培养产量增加16%。
发酵的影响因素及控制
碳源、氮源的影响和控制：
食品发酵工程-2(微生物菌种的选育及保藏)
02
微生物菌种保藏
低温保藏法
总结词
通过降低温度来抑制微生物的生长和代谢，从而延长菌种保 藏时间。
详细描述
将微生物菌种保存在低温环境下，通常为-18℃至-70℃，可以 显著减缓菌种的生长和代谢速度，从而延长菌种保藏时间。低 温保藏法适用于大多数微生物菌种的长期保存。
干燥保藏法
总结词
通过去除水分来降低微生物的生存能 力，从而延长菌种保藏时间。
详细描述
将微生物菌种干燥至一定含水量，通常 为5%-10%，以降低菌种的生存能力。 干燥保藏法适用于耐干燥的微生物菌种， 如霉菌和酵母菌等。
冷冻真空干燥干燥保藏法
总结词
结合低温、干燥和真空条件来更有效地延长菌种保藏时间。
详细描述
在冷冻真空干燥机中，将微生物菌种在低温、真空条件下进行干燥处理，去除 水分，从而延长菌种保藏时间。冷冻真空干燥保藏法适用于对湿度敏感的微生 物菌种，如病毒和细菌等。
03
微生物菌种鉴定
形态学鉴定
总结词
通过观察微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征，初步判断微生物的种类。
详细描述
形态学鉴定是微生物鉴定的基础方法，通过显微观察，可以了解微生物的形态、大小、排列、运动性等特征，从 而判断其大致的分类。
生理生化鉴定
总结词
通过测定微生物对不同碳源、氮源、能源的利用以及产生的代谢产物，进一步确定微生物的种类。
详细描述
根据产物的性质选择合适的分离纯化方法，如离心、 过滤、萃取、沉淀等。通过实验确定最佳的工艺参数 和操作条件，以提高产物的纯度和收率。同时，可以 探索联合使用多种分离方法，以达到更好的分离效果 。
THANKS
感谢观看
的时间和较大的培养规模。
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
发酵制药
生产菌种的建立
药物的筛选
• 琼脂扩散法——活性测定： 非致病菌为对象，筛选生物活性物质。 耐药和超敏菌种。 HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。 • 靶向筛选 • 高通量筛选 • 高内涵筛选
发酵制药
生产菌种的建立
微生物药物与菌种的筛选流程
样品采集
微生物分离
筛选方法学建立
培养
筛选鉴定 新 药 前药－新 化合物分离 研 阳性结果 化合物 纯化鉴定 究 与 开 生产出发菌 菌种鉴定与保藏 发
高产菌株 复筛
单菌落初筛 稳定性 特性 放大 中试
稀释涂板
投入生产
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.4 原生质体融合育种
•概念 通过化学或物理学的方法，使两个不同种 类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞， 产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。 特点：有一定的定向性，效果显著。
发酵制药
操作过程
a. 原生质体制备：
菌株1
生产菌种的建立
菌株2
用去壁酶处理将微生 物细胞壁除去，制成 原生质体。
e.高产菌株
去细胞壁
原生质体1
b.原生质体融合： c.细胞壁再生
原生质体2
高渗，PEG处 理
d.筛选，鉴定 异核体或重组子
hybrid cell
杂合原生质体
发酵制药 10.3.1.5基因组shuffling
生产菌种的建立
概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质 体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选
突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，
即经济适用的菌种。 特点：短时、快速，定向 应用：效果很显著
发酵制药 基因组Shuffling过程
生产菌种的建立
• 突变：随机突变获得单个性状优良的菌株 • 重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再 生，形成第一个融合库（F1） • 筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株 • 多轮循环：再次融合，得到融合库F2、F3、 F4……., 筛选鉴定…… • 结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.1.2 生产选育
• 概念：不经过人工诱变处理，根据菌种 的自然突变而进行的菌种筛选过程。 • 应用： （1）菌种的提纯复壮。（2）防 止退化，稳定生产水平。1年1次。 • 过程 菌 种 单孢 子 平板 分离 单菌落 测活 优良 菌株
效率低（10－E5－E8），增产幅度小
发酵制药
生产菌种的建立
10.3 制药微菌种的建立
• 10.3.1 新药生产菌种的选育 • 10.3.2 菌种保藏 • 10.3.3 菌种库建立与质量控制
制药生产对菌种的要求
• 1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种， 无杂菌及噬菌体。 • 2.易生长性：生长旺盛、迅速； • 4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。 • 3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 • 4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。 • 5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。 菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进 质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用
发酵制药
生产菌种的建立
1年，24,000 次分析
发酵制药
生产菌种的建立
10.3.2 菌种保藏
从而丧失生产能力甚至菌株死亡。
•目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存
•原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，
发酵制药 10.3.1.1 自然分离
生产菌种的建立
• 目的：出发菌的获取 • 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 • 预处理：根据分离目的和微生物的特性。 温度；化学处理；离心、膜过滤 • 培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。 • 分离方法： （1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液 （2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。 • 培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃， 45－50℃；7－14天至1月。
发酵制药
生产菌种的建立
120 units
例1：改良青霉菌 生产青霉素的产量
随机突变育种 方法： • X-射线(X) • 紫外线(UV) • 氮芥(N)
2658 units
发酵制药
E. coli -80 ℃ INV a F' stock CK 0.5
生产菌种的建立
0.5ml 0.5ml
例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）
发酵制药
生产菌种的建立
诱变方案设计
• 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。 • 诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。 中等剂量（80％致死率）。 • 选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。 措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产 物浓度。
发酵制药
生产菌种的建立
诱变育种流程
出发菌种 单孢子悬液 诱变处理
toothpick
-80℃ stock
1 菌落
1 菌落
0.5 ml
-80℃ stock
toothpick
1.0
1.0
1.25
1.25
2 菌落
10 菌落
10 菌落
1.25
1.5
1.5
2.0
2.0
2.5
2.5
发酵制药
生产菌种的建立
生长曲线(选择压2.5M)
1.4
1.2
黑色：出发菌种;蓝色：耐0.5 绿色：耐1.25;红色：耐2.5
1.0
0.8
OD
0.6 0.4 0.2 0.0 0. 5. 10. 15. Hours 20. 25. 30.
发酵制药 生产菌种的建立 例3：提高泰乐菌素生产能力
突变育种 基因组shuffling 效果
出发菌种
Zhang YX, et al., Nature, 415(6872):644-666.
发酵制药 10.3.1.3 诱变育种
生产菌种的建立
• 概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种 发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。 • 物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。 • 化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。 • 生物类：噬菌体，转座子。
特点：快速，简单，效益大。
缺点：无定向性，大量筛选。
制药工艺学
Pharmaceutical Techn
第二篇 生物技术制药工艺
第十章 微生物发酵制药工艺
10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 概述 微生物生长与生产的关系 制药微生物菌种建立 制药微生物培养基制备 灭菌工艺 微生物发酵培养技术 发酵工艺过程的检测与控制