测序通用引物
DNA测序样品的要求
DNA测序样品的要求未纯化PCR产物的要求1. 片段大于200bp；2.请提供50ml PCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ml样品，应该能够清晰的分辨出目的条带；自带引物，引物浓度为5-10uM,并请注明。
备注纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；2.浓度大于20ng/ml，体积大于10ml，长片段需适当增加量；3.电泳检测条带专一；自带引物。
所有模板均应提供相应的引物信息自带质粒的要求1.质粒溶于30~50ml ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大50~100ng/ml；2. 建议用相关试剂盒提取质粒；3. 如有可能，同时提供1ml含有相应质粒的菌液备用；4. 需注明载体和插入目的片段长度、以及测序要求。
菌液模板的要求1.说明载体抗性类型，我们提供A mp, Kan, Tet及Chl四种抗生素；2. 其余类型抗生素需自备；应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1mg纯化质粒；3. 提供1ml左右过夜培养（12h）的菌液，加15%灭菌甘油，于E ppendorf 管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；4. 大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养；5. 建议尽量提供穿刺培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。
自带引物的要求1.浓度不低于5pmol/ml(或5umol/L)，溶液体积15-50ml；2. 随机引物（RA PD引物）和简并引物以及引物长度不足15bp不能用于本公司提供如下通用测序引物：M13+，M13-，T7, SP6, T7 ter，BGH rev, pGL3+, pGL3-，pGEX5’，pGEX3’，5’AOX1，3’A OX1 ，a-factor。
其他引物请自带或提供序列由我们合成。
常用载体特征PCR类型测序模板注意事项∙总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
测序常见问题分析与解答
测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1。
5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
测序引物的要求
• 测序模板的要求
• PCR产物直接测序 • PCR已纯化产物：
提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul (浓度大于50 ng/μl), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl（具体体积视客户反应数相应增加）。 • 未纯化PCR产物： • 提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带, 同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl （具体体积视 客户反应数相应增加）。
6 Invitrogen Proprietary & Confidential
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的四级结构： DNA与蛋白质形成的复合物。如 染色体（质）。
7 Invitrogen Proprietary & Conf本概念
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子 通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。
5 Invitrogen Proprietary & Confidential
。
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形 成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生 物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。
测序引物设计指南[精华]
![测序引物设计指南[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/20fb8738ec630b1c59eef8c75fbfc77da2699777.png)
♦P CR引物设计方法：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
通用引物测序的原理
通用引物测序的原理
通用引物测序是一种用于测定DNA序列的方法，它基于DNA的复制和扩增原理。
通用引物是一段具有特定序列的短DNA片段，能够与目标DNA序列的特定区域进行互补配对。
通用引物通常用于PCR（聚合酶链式反应）或Sanger 测序等技术中。
通用引物测序的原理如下：
1. DNA提取：从样本中提取DNA，并将其纯化。
2. PCR扩增：使用通用引物对目标DNA进行扩增。
通常，每个引物配对目标DNA的两个相邻区域，使其能够扩增出完整的目标序列。
3. PCR循环：PCR反应进行多个循环，每个循环包括DNA的变性、引物的结合和扩增等步骤。
这些循环可以使目标DNA的数量指数级增加。
4. 扩增产物检测：在每个PCR循环的末尾，通过电泳等方法检测扩增产物的大小和数量。
5. 分离扩增产物：将扩增产物分离出来，通常使用凝胶电泳等技术。
6. 测序：对扩增产物进行测序，通常使用Sanger测序方法。
在测序中，通用引物作为测序反应的起始点，通过DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸逐个加入，形成DNA序列。
7. 数据分析：通过计算机软件对测序结果进行分析和解读，得到目标DNA序列。
通用引物测序的优点是可以扩增和测序多个目标序列，适用于不同种类的样本。
同时，通用引物也可以用于筛查和鉴定特定基因或序列的存在。
常见的通用引物序列
5’TGCTAGTTATTGCTCAGCGG3'
S.TAG
5’CGAACGCCAGCACATGGACA3’
T3
5'ATTAACCCTCACTAAAGGGA3’
M13F（47）
5'CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’
M13R（48)
5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3'
TGC GTA CTG CGG TGA TCA AC
P3'
CTG CAA GGC GAT TAA GTT GG
DuetDOWN1
5’-GATTATGCGGCCGTGTACAA-3'
PET Upstream
ATG CGT CCG GCG TAG AGG AT
DuetUP2
5'-TTGTACACGGCCGCATAATC-3’
PTRCHISAF
5’CAT GGT ATG GCT AGC ATG AC3’
PTRCHISAR
5'CAG GCT GAA AAT CTT CTC TC3'
pDC316 F
5’ —TAA CTT GTT TAT TGC AGC —3'
pDC316 A
5' -TAT GCT TAC CGT AAC TTG -3'
PEFF
5' TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC3’
PCEPF
5’ AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG3’
EBVR
5’ GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC3’
CMVF
5'CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG3'
16S多样性测序，到底该选啥引物？！
16S多样性测序，到底该选啥引物？！“微生物组”（Microbiome）是指由多种微生物聚居在一起形成的生态群落，从人和动物的肠道，到植物、土壤、海洋，它们无处不在，推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。
小到一个工厂的污水处理，大到温室气体排放造成气候变暖，人类面临的能源短缺、环境污染、粮食安全、疾病流行等几乎所有问题的背后，都有微生物的身影。
近年来，得益于低成本高通量基因测序技术的发展、计算和成像技术的改进，以及用于数据分析的生物信息学工具的革新等进展，高通量测序走下神坛，变得平易近人，使得更多的学科领域开始投入到微生物组学的研究中来。
对于微生物组学的研究，最常见的就是对微生物群落结构多样性的研究。
也就是通过第二代高通量测序技术（Roche454高通量测序、Illumina MiSeq高通量测序等）对16SrDNA/18S rDNA/ITS等序列进行测序，获得样品中的微生物群落组成以及相对丰度。
探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。
在高通量测序的时代，“16S测序”在各大杂志期刊、学术报告及重大会议中频繁出现，那么你真正了解16S测序吗？为什么选择16S测序？16S测序区域又该如何选择？今天，小圆要跟大家聊一下16S测序中的引物选择。
1、16S 是个啥？16S rRNA 即16Sribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。
16S中的'S'是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。
16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有原核微生物的基因组中。
16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。
随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。
通用引物资料
通用引物通用引物是在分子生物学和遗传学领域中经常使用的一种工具。
它是一种短小的DNA或RNA片段，能够与目标DNA序列的特定区域结合，从而在PCR扩增、测序等实验中起到引导作用。
通过合成设计，通用引物可以用于不同物种的基因组，进行多种特定基因片段的扩增。
这些引物可以广泛应用于DNA重组、基因检测、突变分析、基因定位等多个领域。
通用引物的作用1.PCR扩增：通用引物在PCR扩增中起到引导作用，使目标DNA片段能够快速地被扩增，进而进行后续实验分析。
2.测序：通用引物可以作为测序反应中的引物，帮助确定目标DNA片段的序列，为遗传学研究提供重要数据支持。
3.基因定位：通过设计匹配目标基因的通用引物，可以在基因组中精确定位目标基因，有利于研究基因与表型的关系。
通用引物的设计通用引物的设计需要考虑以下几个方面：•引物长度：通用引物的长度通常在18-25bp之间，适当长度可提高引物的特异性。
•碱基配对：引物的碱基序列应该根据目标序列的碱基组成相对稳定，以确保引物能够特异性地结合目标DNA。
•Tm值：通用引物的退火温度（Tm）应该在50-65摄氏度之间，以保证PCR反应顺利进行。
•GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，有利于提高引物的特异性。
通用引物的应用范围通用引物的应用范围非常广泛，涉及到许多领域：•医学领域：通用引物可以应用于遗传疾病的检测和诊断，对疾病的预防和治疗起到重要作用。
•农业领域：通用引物可以用于农作物的新品种选育、疾病抗性基因鉴定等方面，帮助提高农产品质量和产量。
•生态学研究：通用引物可以用于研究生物多样性、物种鉴定和环境污染的监测等领域，为环境保护和生态平衡提供支持。
结语通用引物作为一种重要的分子生物学工具，在科研和实践中发挥着不可替代的作用。
通过合理设计和应用，通用引物可以帮助研究人员更好地理解基因组学、遗传变异和进化等重要生物学问题，推动科学研究的进步和创新。
随着技术的不断完善和发展，通用引物将继续在生命科学领域中发挥着重要作用，为人类社会的可持续发展和进步做出贡献。
常用载体测序引物列表
常用载体测序引物列表 载体名称 正向引物 反向引物pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD(5’AD) 3'AD/pACT2-R PACYCDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpAD/pl-DEST CMV-FpAD-Track pAD-Track-F 无pAS2-1 5’BD M13-26/48 PB42AD PB42ADF PB42ADR PBAD PBAD-F PBAD-R pBABE pBABE5’ pBABE3’ PBACPAK8 BAC1BAC2 pBK-CMV T7/M13-20 T3/M13-26 PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7T3/M13R pBV220 PBV220F PBV220R pBI121需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 pCAMBIA 1301(1300)需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 pCAMBIA 2300 需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer pGL3+pcDNA3.0 pEGFP-N5/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 pEGFP-N5/T7 BGHpcDNA4 T7/pEGFP-N5 BGHpcDNA6 T7/pEGFP-N5 BGHpcDNAII T7SP6 pCE2.1 M13FM13R pCEP4 pCMV5R/PCEP-F pEGFP-N5/EBV-R pCF-T M13FM13R pCIT7（17Base ） pCMV5R pCI-neo T7（17Base ） T3pCMS-EGFP T7T3 pCMV-3Tag-4A T3 /pFlag-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5FpCMV5R pCMV-MYC/NUC pCMV5FpCMV5R PCMV-HA pCMV5FpCMV5R pCMV-SportSP6/M13RpCMV-Tag T3T7 pCMV-TNT T7/SP6pCMV5R pCR2.1-TOPO M13F/T7M13R pCR3.1 T7BGH pCS2 SP6T7PDNR-LIB M13F M13RpDonar M13F M13R pDONR201 pDONR-F pDONR-R pDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6 pDRIveR T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-C1-F pECFP-C-3 pDsRed1-N1 pEGFP-N-5 RFP-NrevpDsRed-Monomer-N1 pEGFP-N-5 pDsRed1-NpDsRED2-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pEGFP-N-5 pDsRed1-N pDSRED2-N1pDSRED-N1 pEGFP-N-5’ PDSRED-N-R pEASY-BLUNT M13F/T7 M13RTerpEASY-E1 T7 T7pEASY-T1 M13F/T7 M13RpEASY-T3 M13F/T7 M13R/SP6 pECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3' pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1R pEGFP-C pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEGFP-N pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ pENTR/D-TOPO M13F M13RTerpET-*(His) T7 T7pET22(a,b,c) T7 T7TerTerpET28,30,24,49 T7 T7TerpET32(a,b,c) T7/S.tag T7pET-42a (-b, -c)(+) Stag T7 TerpET50 T7/s.tag T7TERpET44 T7/s.tag T7Ter pEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ PETBlue M13-20 PETBlueDOWN PETDUET-1(MCSI) PBRrevBam DuetDOMN1PETDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ pFastBac pFastBac-F pFastBac-R pFastBac HT_A,B,C pFastBac-PH pECFP-C-3 pFastBac1 pFastBac-PH pECFP-C-3 pFastBac Dual (MCSI) pFastBac-PH pECFP-C-3 pFLAG-CMV CMV30/pFLAG-CMV-F CMV-24/pFLAG-CMV-Rp3xFlag-CMV-7.1 CMV-F/CMV24 CMV30pGAD424 5’AD 3'ADpGADGH 5’AD 3'ADpGADT7-Rec 5’AD/T7 3'ADpGAPZa-A/B/C a-FACTOR 3'AOXforward 3'AOXpGAPZ-A/B/C pGAPpGBKT7 T7 3'BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-5’ pGEX-3’pGL2 pCMV5R PGL3-Pgl3-BASIC pGL3+ PGL3-pGL3-Enhancer pGL3+ PGL3-PinPoint TM PinPoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-RpIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’ pIRES2-EGFP.P3’ pLenti6/v5-Dest pEGFP-N-5’PLEXA PLEXA-F PLEXA-R PLNCX PLNCX-F PLNCX-R pLXSN pLXSN-F pLXSN-RPjc1-tac T7pJet.1.21.Blunt T7primer M13F(-47) pMAL-c2E MalEP3/PMAL-C2X-R pMAL-C2x P5/PMAL-C2X-Fprimer M13F(-47) pMAL-p2X MalEPMD18-T M13R(-48) M13F(-47) PMD19-T M13F(-47) M13R(-48) pMIR-report M13FPPC86 PPC86-F PPC86-R3’AOXpPIC9K 5’AOX/a-factor3'AOX pPICZa 5'AOX/PPICZa-FpPROEXHTA M13R(-48)pQE30or40 pQE30+ pQE30- pRECEIVER CMV-FpRSET T7 T7TER PRSFDUET-1(MCSI) DuetUP1 DuetDOWN1 PRSFDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpShuttle-CMV pShuttle-CMV-F pShuttle-CMV-R PSILENCE-1.0-U6 T7 T3pSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0revpSILENCEV2.0-U6 T7 2.0revpSK01-T M13F M13RpSK-CMV T7 T3Psos H1PSP64/65 SP6pSP72 T7 SP6T7/M13RpSport1 SP6/M13F(-47)pSTBlue-1 T7 SP6pSUPER T7 T3pT7Blue(R) T7 M13F(-47)pTA2 M13F/T7 T3/M13R/T7 M13RpT-Adv M13FpTARGET TM pTarget-F/T7 arget-RPTHIOHISA,B,C TRX-FORWARD TRX-REVERSEpTO-T7 T7 T7TERPBV220-/PTRC99C-R pTRC99a-c PQE30+/PTRC99C-FpTriPLEx2 PT5/5'TriplEx2 T7pTz57r/t M13+ M13-pTWIN-1 T7 T7TERpUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)M13F(-47)/M13F pUC57 M13R(-48)/M13RpUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHT3/M13R/M13R(-48) pWSK29 T7/M13F/M13F(-47)pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.R。
Invitrogen中国测序通用引物序列
ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA
pGEX-4T-5'
GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG
pGEX-4T-3'
CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG
GLp1
TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG
GLp2
CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA
PBV220R:
CTG CGT TCT GAT TTA ATC TG
U6
ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA
2.0rev primer:
AGG CGA TTA AGT TGG GTA
3.0rev:
GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGC
S.tag
GAA CGC CAG CAC ATG GAC
pIRES2-EGFP.P5’:
GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG
pIRES2-EGFP.P3’:
AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC
3'AD:
AGA TGG TGC ACG ATG CAC AG
CMV -F
CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG
S1
pCMV-R
TCCAAACTCATCAATGTATC
pTRC99C-F:
TTG CGC CGA CAT CAT AAC
pTRC99C-R:
CTGCGTTCTGATTTAATCTG
pCEP-F:
AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG
EBV-R :
测序通用引物序列
测序通用引物序列常见载体的测序引物：Primer of Vector:Vector：Primer(F)；Primer(R)pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD pACT2-RpAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.RpB42AD pB42ADF pB42ADRpBACPAK8 BAC1 BAC2pBK-CMV T7 T3PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13RpBV220 PBV220F PBV220RpCAMBIA 1301(1300) P1 P2pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47)PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 T7 BGHpcDNA4 T7/CMV-F BGHpcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面）BGHpcDNAII T7 SP6pCE2.1 M13F M13RpCEP4 pCEP-F EBV-RpCF-T M13F M13RpCI T7（17Base）此载体无反向引物pCI-neo T7（17Base）T3pCMS-EGFP T7 T3pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5RpCMV5-Flag pCMV5F pCMV5RpCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-RpCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13RpCMV-Tag(KAN+) T3 T7pCR2.1-TOPO M13F/T7 M13RpCR3.1 T7 BGHpCS2 SP6 T7pDonar M13F M13RpDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6pDRIveR(KAN+) T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’(距离很近,一般不用) pDsRED2-C1(KAN+) pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pDSRED-N1(KAN+) pEGFP-N-5’ PDSRED-N-RpECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3′pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1RpEGFP-C(KAN+) pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pEGFP-N(KAN+) pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pENTR/D-TOPO(KAN+) M13F M13RpET-*(His)(KAN+) T7 T7 TerpET22(a,b,c)(AMP+) T7 T7 TerpET28,30,24,49(KAN+) T7 T7 TerpET32(a,b,c)(AMP+) T7/S.tag T7 TerpET50(amp+) T7/s.tag T7TERpET44(AMP+) T7/s.tag T7 TerpEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pFLAG-CMV pFLAG-CMV -F pFLAG-CMV -R pGAD424 GAL4 AD 3′ADpGADGH GAL4 AD 3′ADpGADT7-Rec GAL4 AD/T7 3′ADpGAPZa-A a-FACTOR 3′AOXpGBKT7(Kana+) T7 3′BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-4T-5’ pGEX-4T-3’pGL2 GLP1 GLP2pGL3 RVP3 GLP2(RVP4)(没有特别说明用GLP2) PinpointTM Vector Pinpoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-R (J40720)pIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’ pIRES2-EGFP.P3’pLXSN pLXSN-F pLXSN-RpMAL-c2E MalE primer M13F(-47)pMAL-C2x P5’ P3’pMAL-p2X MalE primer M13F(-47)PMD18-T M13R(-48) M13F(-47)PMD19-T M13F(-47) M13R(-48)pPIC9K(AMP+、ZEO+）5’AOX/a-factor 3’AOX pPICZa 5′AOX/PPICZa-F 3′AOXpPROEXHTA M13R(-48) 无反向引物pQE30or40 pQE30-F pQE-R:pRSET T7 T7TERpSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0REV pSILENCEV2.0-U6 T7 2.0REVpSK01-T M13F M13RpSK-CMV(KAN+) T7 T3pSP72 T7 SP6pSport1 SP6/M13F(-47) T7/M13RpSUPER T7 T3pTA2 M13F/T7(优先使用M13F）T3/M13RpT-Adv M13F /T7 M13RpTARGET TM pTarget.F(在T7前面）/T7 pTarget.R pTO-T7 T7 T7TERpTRC99a-c pTRC99C-F pTRC99C-RpTriPLEx2 5′pTriPLEx2 T7pTWIN-1 T7 T7TER(客户确认再用）pUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)pUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHpWSK29 T7/M13F/M13F(-47) T3/M13R/M13R(-48)pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.RpLEXA pLEXA-F pLEXA-RpLNCX pLNCX-F pLNCX-RpRECEIVER CMV-F 此载体无反向引物pSHUTTLE-CMV PSHUTTLE-CMV-F PSHUTTLE-CMV-R pSP64/65 SP6 此载体无反向引物pSTBlue-1 T7 SP6pT7Blue(R) T7 M13F(-47)引物名称序列(5′-3′)：M13R：CAG GAA ACA GCT ATG ACCM13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGTM13F(-47)：CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GACM13R(-48)：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGAM13(-96)：CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGSP6：ATT TAG GTG ACA CTA TAGT7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GGT3：ATT AAC CCT CAC TAA AGG GApGEX-4T-5′：GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3′：CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1：TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TGGLp2：CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CARVp3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCRVp4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGpcDNA3.1R：TAG AAG GCA CAG TCG AGGPinPoint primer：CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F：TCT AAA AGC TGC GGA ATT GTpCMV-R：TCCAAACTCATCAATGTATCpTRC99C-F: TTG CGC CGA CAT CAT AACpTRC99C-R: CTGCGTTCTGATTTAATCTGpCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CGEBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TCpIRES2-EGFP.P5’: GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC3′AD: AGA TGG TGC ACG ATG CAC AGCMV -F：CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTGS1：CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGCS6：GTA AAT GAA TTT TCT GTA GTA GG5`AOX1：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC3`AOX1：GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCCα-Factor：TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGCGAL4 AD：TAC CAC TAC AAT GGA TGpACT2-R：GTGCACGATGCACAGTTGAApB42ADF：CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG ATGpB42ADR：AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA GpEGFP-N-5’：TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA G pEGFP-N-3’：CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G pEGFP-C-5’：CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G pEGFP-C-3′ ：TAT GGC TGA TTA TGA TCA GTPBV220F：AAG AAG GGC AGC ATT CAA AGPBV220R：CTG CGT TCT GAT TTA ATC TGU6：ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA2.0rev primer：AGG CGA TTA AGT TGG GTA3.0rev：GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGCS.tag：GAA CGC CAG CAC ATG GAC5′TriplEx2：CTC CGA GAT CTG GAC GAG CRVP4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGRVP3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCpQE30-R：GTT CTG AGG TCA TTA CTG GpQE30-F：TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACpEF-F：TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTCpDSRED-N1-R：TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG pDsRED-express-C1-F：TCC CAC AAC GAG GAC TAC AC pCMV5R：ATT ATA GAG GAC ACC TAG TCpCMV5F：TTC CAA AAT GTC GTA ATA ACP5′：TGC GTA CTG CGG TGA TCA ACP3′：CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGBAC2：ACG CAC AGA ATC TAG CGC TTBAC1：AAC CAT CTC GCA AAT AAA TA3′BD：TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT AC pTarget.F：CCA GGA TTT TCC CAG TCA CpTarget.R：GGC TTT ACA CTT TAT GCT TCT7(17base)：ACA TCC ACT TTG CCT TTC TCpYes2.R：TCG GTT AGA GCG GAT GTGGAL4 BD：TCA TCG GAA GAG AGT AGpAS2-1.R：AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA ApFlag-CMV-F: GGT AGG CGT GTA CGG TGGpFlag-CMV-R: GCA CTG GAG TGG CAA CTTpIRES-F: CTT ACT GAC ATC CAC TTT GCpIRES.R: CAC TGC ATT CTA GTT GTG GTP1：CCA GGC TTT ACA CTT TAT GCP2：GCG ATT AAG TTG GGT AAC GCpLEXA-F：CGT CAG CAG AGC TTC ACC ATpLEXA-R：TAA AAC CTA AGA GTC ACT TTpLNCX-F：AGC TCG TTT AGT GAA CCG TCA GAT CG pLNCX-R：ACC TAC AGG TGG GGT CTT TCA TTC CC pLXSN-F：CTT GAA CCT CCT CGT TCG ACpLXSN-R：GTT GCT GAC TAA TTG AGA TGpSHUTTLE-CMV-F：GGT CTA TAT AAG CAG AGG TG pSHUTTLE-CMV-R：GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG MalE Primer：GGT CGT CAG ACT GTC GAT GAA GCC。
测序引物设计指南
测序引物设计指南♦PCR引物设计方法：1。
引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对(Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2。
引物长度一般在15～30碱基之间。
引物长度(primerlength）常用的是18—27bp，但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应.3。
引物GC含量在40%~60％之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量(composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm 值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下，50％寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度,一般高于Tm值5～10℃。
若按公式Tm=4（G+C)+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
5。
引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6。
碱基要随机分布.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发（Falsepriming).降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
表4 主要使用的引物及序列
表4 主要使用的引物及序列序列技术在现代生物学研究中发挥着越来越重要的作用。
在进行序列分析之前，需要先选择合适的引物，以确保检测到所需的目标序列，并避免检测到不必要的杂交或引物间的相互杂交。
本文将介绍主要使用的引物及其序列。
1. 基因测序引物基因测序引物是用于测序DNA或RNA的引物。
这些引物通常包括一个DNA或RNA序列和一个与之匹配的引物序列。
常用的基因测序引物包括以下几种：- M13引物M13引物是一种通用的测序引物，用于测序单链DNA。
其序列为：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'。
- T7和SP6引物T7和SP6引物用于测序DNA文库中的克隆DNA。
其中T7引物的序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，SP6引物的序列为：5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3'。
- M13F和M13R引物M13F和M13R引物也用于测序单链DNA。
M13F引物的序列为：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'，M13R引物的序列为：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。
- T3和T7引物T3和T7引物与RNA兼容，并用于测序RNA和RNA-DNA杂交分子。
T3引物的序列为：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGA-3'，T7引物的序列为：5'-TAATACGACTCACTATAG-3'。
2. PCR引物PCR引物是用于荧光定量PCR、数字PCR、标准PCR等技术的引物。
以下是几种常用的PCR引物：- GAPDH引物GAPDH引物用于检测人体组织中的GAPDH基因表达水平。
其序列为：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（前引物）、5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（后引物）。
古菌通用引物测序
古菌通用引物测序
古菌是生活在极端环境中的微生物，与细菌和真核生物不同。
为了对古菌进行基因测序，通常需要使用古菌特有的引物进行PCR扩增。
以下是古菌通用引物的测序步骤：
1.准备样品：从极端环境中采集古菌样品，并使用适当的培养基进行培养。
或者，可以使用已分离的古菌DNA样品。
2.DNA提取：将古菌细胞从培养基中分离出来，并使用DNA提取试剂盒或
传统的酚-氯仿提取法提取DNA。
3.引物设计：根据古菌的基因组序列设计通用引物。
常用的古菌通用引物包
括16S rRNA基因的通用引物和古菌特异性引物。
4.PCR扩增：使用设计的引物和适当的PCR反应体系，在PCR仪中进行扩
增反应。
反应条件需要根据具体的引物和样品进行调整。
5.产物测序：将扩增产物送至测序公司进行测序。
测序方法可以采用传统的
Sanger测序或新一代测序技术。
6.数据分析：对测序结果进行质量控制和数据分析，包括序列拼接、物种鉴
定、基因注释等。
7.结果解释：根据数据分析结果，对古菌的种类、基因组结构和功能进行解
释和讨论。
需要注意的是，由于古菌的基因组结构和组成与细菌和真核生物存在较大差异，因此在测序和分析过程中可能需要进行一些特殊的处理和调整。
同时，由于古菌生活在极端环境中，其基因组中可能存在大量的稀有碱基和修饰碱基，这也需要在测序和分析过程中加以考虑和处理。
测序DNA引物列表
M13F M13F（-47）
5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’ 5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’
M13F-21
5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’
M13R M13R（-48）
5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’ 5′-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3’
P12584
5′-TTT TCA GTA TCT ACG AT-3’
P17110
5′-TAC CAC TAC AAT GGA TG-3’
pbd-gal4- f
5′-GCC TCT AAC ATT GAG ACA GC-3’
pbd-gal4-r
5′-AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA A-3’
PIRES2-EGFP-F 5′-GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG-3’
PIRES3-EGFP-R 5′-AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC-3’
pMAL-C2X-F pMAL-C2X-R PQE30F PQE30R RVP3 RVP4 S.TAG SP6 T3 T7 T7（17BASE） T7TER NOSR
5′ -TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG-3’
GLP2
5′ -CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA-3’
M13(-96)
5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’
M13-20
5′-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3’
A-FACTOR
PCR类型测序模板注意事项
PCR类型测序模板注意事项总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR 产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进行测序。
有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。
有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。
纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。
与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。
测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：∙PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N 值。
通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。
测序通用引物序列
测序通用引物序列常见载体的测序引物：Primer of Vector:Vector：Primer(F)；Primer(R)pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD pACT2-RpAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.RpB42AD pB42ADF pB42ADRpBACPAK8 BAC1 BAC2pBK-CMV T7 T3PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13RpBV220 PBV220F PBV220RpCAMBIA 1301(1300) P1 P2pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47)PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 T7 BGHpcDNA4 T7/CMV-F BGHpcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面）BGHpcDNAII T7 SP6pCE2.1 M13F M13RpCEP4 pCEP-F EBV-RpCF-T M13F M13RpCI T7（17Base）此载体无反向引物pCI-neo T7（17Base）T3pCMS-EGFP T7 T3pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5RpCMV5-Flag pCMV5F pCMV5RpCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-RpCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13RpCMV-Tag(KAN+) T3 T7pCR2.1-TOPO M13F/T7 M13RpCR3.1 T7 BGHpCS2 SP6 T7pDonar M13F M13RpDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6pDRIveR(KAN+) T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’(距离很近,一般不用) pDsRED2-C1(KAN+) pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pDSRED-N1(KAN+) pEGFP-N-5’ PDSRED-N-RpECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3′pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1RpEGFP-C(KAN+) pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pEGFP-N(KAN+) pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pENTR/D-TOPO(KAN+) M13F M13RpET-*(His)(KAN+) T7 T7 TerpET22(a,b,c)(AMP+) T7 T7 TerpET28,30,24,49(KAN+) T7 T7 TerpET32(a,b,c)(AMP+) T7/S.tag T7 TerpET50(amp+) T7/s.tag T7TERpET44(AMP+) T7/s.tag T7 TerpEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pFLAG-CMV pFLAG-CMV -F pFLAG-CMV -R pGAD424 GAL4 AD 3′ADpGADGH GAL4 AD 3′ADpGADT7-Rec GAL4 AD/T7 3′ADpGAPZa-A a-FACTOR 3′AOXpGBKT7(Kana+) T7 3′BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-4T-5’ pGEX-4T-3’pGL2 GLP1 GLP2pGL3 RVP3 GLP2(RVP4)(没有特别说明用GLP2) PinpointTM Vector Pinpoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-R (J40720)pIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’ pIRES2-EGFP.P3’pLXSN pLXSN-F pLXSN-RpMAL-c2E MalE primer M13F(-47)pMAL-C2x P5’ P3’pMAL-p2X MalE primer M13F(-47)PMD18-T M13R(-48) M13F(-47)PMD19-T M13F(-47) M13R(-48)pPIC9K(AMP+、ZEO+）5’AOX/a-factor 3’AOX pPICZa 5′AOX/PPICZa-F 3′AOXpPROEXHTA M13R(-48) 无反向引物pQE30or40 pQE30-F pQE-R:pRSET T7 T7TERpSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0REV pSILENCEV2.0-U6 T7 2.0REVpSK01-T M13F M13RpSK-CMV(KAN+) T7 T3pSP72 T7 SP6pSport1 SP6/M13F(-47) T7/M13RpSUPER T7 T3pTA2 M13F/T7(优先使用M13F）T3/M13RpT-Adv M13F /T7 M13RpTARGET TM pTarget.F(在T7前面）/T7 pTarget.R pTO-T7 T7 T7TERpTRC99a-c pTRC99C-F pTRC99C-RpTriPLEx2 5′pTriPLEx2 T7pTWIN-1 T7 T7TER(客户确认再用）pUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)pUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHpWSK29 T7/M13F/M13F(-47) T3/M13R/M13R(-48)pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.RpLEXA pLEXA-F pLEXA-RpLNCX pLNCX-F pLNCX-RpRECEIVER CMV-F 此载体无反向引物pSHUTTLE-CMV PSHUTTLE-CMV-F PSHUTTLE-CMV-R pSP64/65 SP6 此载体无反向引物pSTBlue-1 T7 SP6pT7Blue(R) T7 M13F(-47)引物名称序列(5′-3′)：M13R：CAG GAA ACA GCT ATG ACCM13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGTM13F(-47)：CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GACM13R(-48)：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96)：CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGSP6：ATT TAG GTG ACA CTA TAGT7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GGT3：ATT AAC CCT CAC TAA AGG GApGEX-4T-5′：GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3′：CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1：TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TGGLp2：CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CARVp3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCRVp4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGpcDNA3.1R：TAG AAG GCA CAG TCG AGGPinPoint primer：CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F：TCT AAA AGC TGC GGA ATT GTpCMV-R：TCCAAACTCATCAATGTATCpTRC99C-F: TTG CGC CGA CAT CAT AACpTRC99C-R: CTGCGTTCTGATTTAATCTGpCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CGEBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TCpIRES2-EGFP.P5’: GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC3′AD: AGA TGG TGC ACG ATG CAC AGCMV -F：CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTGS1：CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGCS6：GTA AAT GAA TTT TCT GTA GTA GG5`AOX1：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC3`AOX1：GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCCα-Factor：TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGCGAL4 AD：TAC CAC TAC AAT GGA TGpACT2-R：GTGCACGATGCACAGTTGAApB42ADF：CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG ATGpB42ADR：AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA GpEGFP-N-5’：TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA G pEGFP-N-3’：CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G pEGFP-C-5’：CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G pEGFP-C-3′ ：TAT GGC TGA TTA TGA TCA GTPBV220F：AAG AAG GGC AGC ATT CAA AGPBV220R：CTG CGT TCT GAT TTA ATC TGU6：ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA2.0rev primer：AGG CGA TTA AGT TGG GTA3.0rev：GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGCS.tag：GAA CGC CAG CAC ATG GAC5′TriplEx2：CTC CGA GAT CTG GAC GAG CRVP4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGRVP3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCpQE30-R：GTT CTG AGG TCA TTA CTG GpQE30-F：TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACpEF-F：TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTCpDSRED-N1-R：TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG pDsRED-express-C1-F：TCC CAC AAC GAG GAC TAC AC pCMV5R：ATT ATA GAG GAC ACC TAG TCpCMV5F：TTC CAA AAT GTC GTA ATA ACP5′：TGC GTA CTG CGG TGA TCA ACP3′：CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGBAC2：ACG CAC AGA ATC TAG CGC TTBAC1：AAC CAT CTC GCA AAT AAA TA3′BD：TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT AC pTarget.F：CCA GGA TTT TCC CAG TCA CpTarget.R：GGC TTT ACA CTT TAT GCT TCT7(17base)：ACA TCC ACT TTG CCT TTC TCpYes2.R：TCG GTT AGA GCG GAT GTGGAL4 BD：TCA TCG GAA GAG AGT AGpAS2-1.R：AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA ApFlag-CMV-F: GGT AGG CGT GTA CGG TGGpFlag-CMV-R: GCA CTG GAG TGG CAA CTTpIRES-F: CTT ACT GAC ATC CAC TTT GCpIRES.R: CAC TGC ATT CTA GTT GTG GTP1：CCA GGC TTT ACA CTT TAT GCP2：GCG ATT AAG TTG GGT AAC GCpLEXA-F：CGT CAG CAG AGC TTC ACC ATpLEXA-R：TAA AAC CTA AGA GTC ACT TTpLNCX-F：AGC TCG TTT AGT GAA CCG TCA GAT CG pLNCX-R：ACC TAC AGG TGG GGT CTT TCA TTC CC pLXSN-F：CTT GAA CCT CCT CGT TCG ACpLXSN-R：GTT GCT GAC TAA TTG AGA TGpSHUTTLE-CMV-F：GGT CTA TAT AAG CAG AGG TG pSHUTTLE-CMV-R：GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG MalE Primer：GGT CGT CAG ACT GTC GAT GAA GCC。
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BGH rev,c-mycrev
pcDNA4/TO
TREfor/CMV-Profor
BGH rev
pcDNA4/V5-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pcDNA4-TET/ON/AMP+
CMV-Profor
pcDNA5/FRT
T7/CMV-Profor
T7
T7-Terminator
pET-25b(+)
T7
T7-Terminator
pET-26b(+)
T7
T7-Terminator
pET-27b(+)
T7
T7-Terminator
pET-28a(-b,-c)(+)
T7
T7-Terminator
pET-29a(-b,-c)(+)
S.tag/T7
T7-Terminator
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRED2-C1(KAN+)
pDsRED-ex-C1-F
pEGFP-N-3’
pDsRed-Express
dsRed1_N_primer/CMV-F
dsRed1_C_primer/CMV-R
pDSRED-monomer-N1(KAN+)
dsRed1_N_primer
EGFP-Nrev/ PEGFP-N-3′
pEGFP-C
PEGFP-C-5′
PEGFP-C-3′
pEGFP-C1
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-C2
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-C3
EGFP-Cfor
SV40-pArev
pEGFP-F
EGFP-Cfor
SV40-pArev
T7
pCMV-Sport6
T7/M13for
SP6/M13rev
pCOLADuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pCOLADuet-1(MCSII)
DuetUP2
T7TER
pCR2.1
T7,M13for
M13rev
pCR2.1-TOPO
M13for,T7
M13rev
M13R
pEASY-T3
M13F/T7
M13R/SP6
pECFP-N(C)
PECFP-N-5.
PECFP-N-3,
pEF/myc/cyto/ER/mito/nuc
pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/myc-His)
T7/pEF-5
Pcdna3.1R/BGH rev
pEF1(4,6/V5-His)
pDONR223
M13F
M13R
pDrive
T7/M13rev
SP6/M13for
pDsRED1-C1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed1-N1
CMV-Profor
RFP-Nrev,CMV-R?
pDsRed2-N1
(DsRed1-N-f)
DsRed1-C-r
pDsRed2-C1
pBudCE4.1(MCSII)
EF-1α Fwd
BGH
pBudCE4.1/lacZ/CAT
CMV-Profor,T7
c-mycrev,EBVrev
pBV220
pBV220F
PBV220R
pCAL-c
T7/Tac-Profor
T7-Terminator
pCAL-n
T7/Tac-Profor
T7-Terminator
BAC1
BAC2
pBAD
pBAD-F
pBAD-R
pBAD/HisABC
pBAD-5'
pBBR1MCS
T3/M13rev
T7/M13for
pBD-GAL4
pBD-GAL4-F
PBD-GAL4-R
pBI121
35S
NOS
pBIND
GAL4-Bdfor
T3,EBVrev
pBK-CMV
M13F/T7
M13R/T3
EBVrev
pCI-neo
T7（17BASE）
EBVrev,T3
pCMS-EGFP
T7
T3
pCMS-EGFP
T7
EBVrev,T3
pCMV-3Tag-4A
T3 /PFLAG-CMV-F
T7
pCMV5
pCMV5F
PCMV5R
pCMV6
CMV-Profor
pCMV6-3、HGHrev
pCMV6-XL4
CMV-Profor/T7
pDEST26
TREfor/CMV-Profor
T7/M13for
pDisplay
T7/CMV-Profor
c-mycrev
pDNR-LIB(MCS_A)
M13for,T7
pSG5-3,M13R
pDonar
M13F
M13R
pDONR201
PDONR-F
PDONR-R
pDONR207
PDONR-F
PDONR-R
pCAMBIA1301(1300)
pCAMBIA1301-5'(ECORI)/M13R
pCAMBIA1301-3'(HindIII)
pCAMBIA1304
pCAMBIA1301-5'(ECORI)
pCAMBIA1301-3'(HindIII)
pCAMBIA2300
M13R(-48)
M13F(-47)/M13F(-49)
BGH rev
pcDNA6/myc-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,c-mycrev
pcDNA6/V5-His(_A,_B,_C)
CMV-Profor,T7
BGH rev,V5rev
pCEP4
pCEP-F/CMV-Profor
EBVrev
pCI
T7（17BASE）
pET-12(-a,-b,-c)
T7
T7-Terminator
pET-14b
T7
T7-Terminator
pET-15b
T7
T7-Terminator
pET-16b
T7
T7-Terminator
pET-17b
T7
T7-Terminator
pET-17xb
T7
T7-Terminator
pET-19b
T7
T7-Terminator
pET-20b(+)
T7
T7-Terminator
pET-21(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
T7-Terminator
pET-22b(+)
T7
T7-Terminator
pET-23(-a,-b,-c,-d)(+)
T7
T7-Terminator
pET-24(-a,-b,-c,-d)(+)
pCANTB5E
S1
S6
pCAT3-enhancer
RVP3
此载体无反向引物
pCDFDuet-1(MCSI)
ACYCDuetUP1 Primer
DuetDOWN1
pCDFDuet-1(MCSII)
DuetUP2
T7TER
pcDNA1.1
CMV-Profor,T7
pCDM8-3
pcDNA2.1
M13for/T7
pCR3.1
T7
BGH rev
pCR3.1-Uni
T7
BGH rev
pCR4
T3/M13rev
T7/M13for
pCR4-Blunt
T3/M13rev
T7/M13for
pCR4-TOPO
M13rev,T3
M13for,T7
pCR-Blunt
M13rev
T7,M13for
pCR-BluntII
M13rev/SP6
pCMV6-3、HGHrev
pCMV-HA
PCMV-F,CMV-Profor,TREfor
PCMV-R，EBVrev
pCMV-MYC(AMP+)
PCMV-F
PCMV-R, EBVrev
pCMVmyc/nuc
CMV-Profor
BGH rev,c-mycrev
pcmv-scriptEXVector
T3
pcDNA3.3TOPOTA
CMV-Profor
TKPAreverse
pcDNA4/HisMax(_A,_B,_C)
Xpressfor
BGH rev
pcDNA4/HisMax-TOPO
Xpressfor
BGH rev
pcDNA4/HisMax-TOPO/lacZ
Xpressfor
BGH rev
pcDNA4/myc-His(_A,_B,_C)
pAdEasy-1
not available
not available
pAdTrack-CMV
not available
not available
pAS2-1
GAL4 Bdfor/P24990
pGAL4-BDrv/P31430