白介素12的抗肿瘤机

no Rx
IL-12 alone Cy alone
Cy+IL-12
18天腹腔实体MCA207肿瘤
14天静脉注射建立的肺扩散肿瘤模型
Cy+IL-12在腹腔及肺扩散肿瘤模型中的治疗效果
接瘤途径
i.p.腹腔 i.p.腹腔 i.v.肺扩散 i.v.肺扩散
治疗（起始天数） 对照
Cy+IL-12 (18)
Cy+IL-12的抗肿瘤作用是Th1型T免疫应答
宿主
正常 裸鼠 （T和B细胞缺失） T细胞受体敲除鼠
（T细胞缺失）
治愈率
10/10 0/5 0/20 0/20 10/10
咖玛干扰素敲除鼠 （Th 1型缺失）
白介素-4敲除鼠 （Th 2型缺失）
与肿瘤排斥所对应的强免疫反应
治疗之前
CD4 治疗之后
CD8
白细胞介素12的抗肿瘤机理研究
斯坦福大学医学院外科 宗康拉
内容提要
• • • • • • 白介素12的抗肿瘤效果 白介素12的抗肿瘤机理 白介素12可能的临床应用 白介素12的历史 白介素12在国外的现状 白介素12申报国内肿瘤治疗的可行性
白介素12的抗肿瘤效果
Interleukin 12 (IL-12) 白介素12
提高预存免疫可以增强化疗疗效
• • • • 单独化疗不足以治愈大肿瘤负担 提高预存免疫可以通过转入抗肿瘤Ｔ细胞实现 单纯转入抗肿瘤Ｔ细胞无法看到明显抗肿瘤效果 如果在提高预存免疫之后开始化疗呢？
提高预存免疫可以增强化疗疗效的实例
（先过继抗肿瘤免疫细胞后再化疗的试验）
无治疗对照
肿 瘤 大 小
过继抗肿瘤脾细胞
其他化疗药与白介素12的联合使用疗效
化疗+IL-12
环磷酰胺 阿霉素（全身） 阿霉素（瘤内，脂质体） 建择（全身） 建择（瘤内，自由体） 5氟 长春碱
治愈率（%）
80－100 0 60－100 0－20 20－40 0 0
肿瘤模型：2－4周MCA207皮下肿瘤， 10－17毫米直径 治疗：化疗单次给药，3天后开始白介素12（隔天一次x3次） 化疗或者白介素12单独对照＝0%治愈率
模型：10－14天MCA207皮下肿瘤
宿主必须具备预存免疫
• 免疫型（immunogenic)与非免疫性（nonimmunogenic）肿瘤的差别
– 免疫型：能在宿主中诱发免疫识别的肿瘤 – 非免疫性：不能诱发免疫识别的肿瘤 – 免疫型与非免疫型是个相对概念
• 加强预存免疫可以提高疗效
– 预存免疫是另一个保障化疗疗效的必要条件 – 肿瘤疫苗的作用
抗原集中释放期
单独化疗有效期 -2 0 抗肿瘤T细胞过继 局部树突细胞注射 7
14
有效
无效
化疗激活抗肿瘤免疫的直接证据
• 体内测试：Winn氏法检验脾细胞抗肿瘤活性 • 体外测试：肿瘤抗原刺激下的T细胞干扰素释放 • 瘤内检验：化疗前后T细胞浸润对比
Winn氏法检验脾细胞抗肿瘤活性
• • • • • 肿瘤与脾（免疫）细胞混合后接种 无抗肿瘤能力的脾细胞能促进成瘤（feeder） 有抗肿瘤能力的脾细胞能抑制成瘤 抗肿瘤能力是否特异可以用不相关肿瘤做对照 特异性表明是T细胞应答
肿瘤
<10% <30% <60% >50% >70% <10% >50% <10% >30%
白细胞
<10% <30% 30-50% >50% >70% >50% <10% >30% <30%
疗效 Treg （与对照比较）
无 弱 显 强 强 无 显 无 显
>70% >90% 100% 100% 100% ? ? ? ?
预存免疫的状态决定IL-12或Cy+IL-12疗效
免疫细胞转导试验步骤
正常供体小鼠
肿瘤疫苗
T细胞缺失受体小鼠
肿瘤接种
14 day
肿瘤接种
T cell
输入T细胞
2 day
IL-12/Cy+IL-12 治疗 治疗效果?
排斥接种
预存免疫在白介素12治疗中的关键作用
输入细胞
无 未分化T细胞 未分化T细胞 未分化T细胞 肿瘤特异T细胞 肿瘤特异T细胞
由抗原呈递细胞在受到外源物质（包括内毒素）刺 激时分泌 属于“危险信号”之一：和外源侵入相关 修饰T细胞或者NK细胞，决定后天免疫走向 先天免疫与后天获得性免疫之间的衔接因子 刺激靶细胞g-干扰素分泌（Th1型免疫应答） 至今发现的最有效的抗肿瘤单因子 作用与范围与内毒素十分相似 单独用药可以治愈小肿瘤（<1cm)
药物必须对肿瘤细胞有足够的直接杀伤
对体细胞及肿瘤的杀伤 药物及剂量
环磷酰胺－25mg/kg 环磷酰胺－50mg/kg 环磷酰胺－75mg/kg 环磷酰胺－100mg/kg 环磷酰胺－125mg/kg 阿霉素－10mg/kg 全身 阿霉素－5mg/kg瘤内 建择－150mg/kg全身 建择－50mg/kg瘤内
-2天过继未分化脾细胞+Cy -2天过继抗肿瘤脾细胞+Cy
化疗开始后天数
１）14天的MCA207肿瘤模型；２）细胞转导后第三天化疗
过继预存免疫需要在化疗前或者3天之内而不是化 疗有效后（7天）实施才会有效
Cy
肿 瘤 大 小
Cy 7天+过继抗肿瘤脾细胞 Cy 3天+过继抗肿瘤脾细胞
化疗开始后天数
过继的抗肿瘤免疫细胞是否被化疗释放的肿 瘤抗原激活？
• 通过观察成瘤的时间和成（抑）瘤率可以测试脾 细胞中是否含有特异抗肿瘤免疫细胞 • 肿瘤免疫的金标准
化疗前后宿主体内抗肿瘤免疫能力的对比
化疗后10天
抑 瘤 率
对照
对照： 1）未分化脾细胞+207肿瘤 2）207免疫脾细胞+203肿瘤
பைடு நூலகம்
化疗后7天 化疗后3天
接瘤后时间（天）
化疗前后宿主脾细胞对肿瘤抗原的体外应答
受体：带MCA207肿瘤14天的T细胞缺失小鼠
预存免疫是决定荷瘤鼠对白介素12治 疗应答与否的关键条件 为什么？
白介素12受体表达特征
• 未分化T细胞不表达白介素12 受体（不受影响） • 激活的T细胞表达白介素12受体 • 表达为激活后的3－7天内，以后不再表达
环磷酰胺加白介素12疗效解释上的一个困惑
正常鼠+环磷酰胺 肿 瘤 大 小 T细胞敲除鼠+环磷酰胺 正常鼠+对照 T细胞敲除鼠+对照
治疗开始后天数
阿霉素与建择在正常与T细胞缺失鼠中的疗效对比
正常鼠+阿霉素 肿 瘤 大 小 T细胞敲除鼠+阿霉素 正常鼠+建择 T细胞敲除鼠+建择
治疗开始后天数
相似的疗效差异用T细胞清除抗体也能看到
环磷酰胺 肿 瘤 大 小 环磷酰胺+ 抗CD4/CD8 阿霉素 阿霉素+抗CD4/CD8
抗原集中释放期
单独化疗有效期 -2 0 7
14
有效 无效
抗肿瘤T细胞过继
化疗后伴随的肿瘤坏死
MCA207肿瘤对照
环磷酰胺3天后
化疗后局部注射树突细胞可以提高疗效
对照
肿 瘤 大 小
Cy Cy+ DC (6天) Cy+ DC (2天)
化疗开始后天数
过继的抗肿瘤免疫细胞是否被化疗释放的肿 瘤抗原激活？
治疗开始后天数
抗CD4/CD8
大肿瘤模型中T细胞对化疗疗效的贡献
T细胞敲除鼠+环磷酰胺 肿 瘤 大 小 正常鼠+环磷酰胺
治疗开始后天数
化疗是如何激活抗肿瘤免疫的呢？
• 药物对肿瘤细胞的直接杀伤是必要条件
– 排除去抑制解释：杀死抑制性T细胞（Treg）
• 直接杀伤导致抗原短期集中释放 • 释放的肿瘤抗原不足以启动全新的抗肿瘤应答， 但可以激活预存的抗肿瘤应答
去除免疫抑制在我们的肿瘤模型中不 起关键作用
其他解释？ 化疗对肿瘤的杀伤导致抗原释放激活预存免疫
化疗激活抗肿瘤免疫？
我们做的是化疗还是免疫治疗？
预存免疫的状态决定化疗疗效
免疫参与对化疗疗效的贡献
化疗的疗效在没有免疫功能的情况下会不同吗？
无法在人体内进行对比 但可以在试验小鼠体内进行对比
T细胞对肿瘤发展与化疗疗效的影响
如果对白介素12应答好坏由受体表达决定， 那化疗是如何提高白介素12受体表达的？
传统的解释
• 肿瘤晚期免疫受到抑制
– 抑制性T细胞（Treg）生成 – T细胞不表达白介素12受体 – 对白介素12单独治疗不应答
• 化疗药杀死Treg
– 抑制性T细胞由于代谢较高，对化疗药敏感 – 去除抑制性T细胞之后释放了被抑制的抗肿瘤应答 – 抗肿瘤T细胞被激活，表达白介素12 受体
白介素12 结合化疗治疗 32天小鼠MCA207肿瘤模型：治疗前
环磷酰胺加白介素12（Cy+IL-12)治疗一周
环磷酰胺加白介素12治疗2周
环磷酰胺加白介素12治疗3周
环磷酰胺加白介素12治疗4周
环磷酰胺加白介素12治疗5周
环磷酰胺加白介素12治疗6周
通过白介素12提高化疗的抗肿瘤效果
免疫型肿瘤 与 共存(预存)免疫的概念
免疫型肿瘤就是能够在接种后不久自动 诱发宿主免疫识别的肿瘤
识别的结果＝肿瘤生长与抗肿瘤免疫共存
什么是共存（预存）免疫？
肿瘤与抗肿瘤免疫之间的平衡 • 宿主免疫系统对肿瘤抗原有特异性识别 • 肿瘤通过提供抗原维持这个免疫应答 • 这个免疫应答对肿瘤有遏制作用 • 应答的性质属于Th1型细胞应答
白介素12启动的抗肿瘤免疫细胞分布
T细胞
例子1
巨嗜细胞
例子2
巨噬细胞可能是靶效应细胞的证据
H&E组织学染色 巨嗜细胞染色
T 细胞染色
TUNEL自杀细胞染色
白介素12启动的抗肿瘤免疫应答对肿瘤增生的抑制
对照
溴嘧啶标记肿瘤增生
治疗
环磷酰胺加白介素是否对所有肿瘤有效？
有效肿瘤模型: C57B/6: MC203, MCA205, MCA207, FBL-3 BALB/c: CT26, CSA1M, OV-HM A/J: Sa1 无效肿瘤模型: C57BL/6: MCA101,B16, LLC, Pan02, EL-4 C57BL/6: autochthonous primary tumors BALB/c: 4T1, S180
Cy+IL-12
0/5 0/5 3/5 5/5 0/5 0/5 5/5
荷瘤10天脾脏T cell 荷瘤10天脾脏T cell
荷瘤10天脾脏T cell 荷瘤28天脾脏T cell 荷瘤28天脾脏T cell 荷瘤28天脾脏T cell
生理盐水
IL-12 Cy+IL-12 生理盐水 IL-12 Cy+IL-12
治疗
IL-12 生理盐水 IL-12 Cy+IL-12 生理盐水 IL-12 Cy+IL-12
治愈率
0/10 0/8 0/8 0/5 1/10 9/12 10/10
肿瘤特异T细胞
受体：带MCA207肿瘤14天的T细胞缺失小鼠
荷瘤鼠作为T细胞供体（预存免疫）的试验
供体细胞 治疗手段 治愈率
荷瘤0天脾脏T cell
如何做肿瘤治疗效果试验
0-30 天
肿瘤细胞
治疗
能发表的疗效 1) 抑制性作用 (>90%) 2) 肿瘤体积减小（少见) 3) 治愈 （罕见)
白介素１２单独使用的最佳治疗效果实例
• 白介素１２单独治疗一般只对某些初期建立的小 肿瘤（<１０毫米直径）有效
• 除了手术切除，常规以及以前开发的免疫治疗对 于长期建立（>3周）的大肿瘤负担（>15毫米直 径，５%体重）一般无法治愈 • 白介素１２配合化疗在某些肿瘤模型有出奇的疗 效
治愈率（存活天）
0/5 (20-27) 5/5 (>90) 0/5 (21-31) 8/8 (>90)
对照
Cy+IL-12 (14)
IL-12和Cy+IL-12在Sa1腹水肿瘤模型中的治疗效果
Cy+IL-12
100%
Cy
存活率
对照
IL-12
50%
0%
0 接种 10 治疗 20 30 40
天数
白介素12的抗肿瘤机理研究
• • • • • • 细胞免疫（Th 1型）应答是抗肿瘤的最佳应答 抗肿瘤特异的T细胞受到抗原刺激时分泌干扰素 脾细胞与加了肿瘤抗原的树突细胞共培养 测试伽玛干扰素的分泌 伽玛干扰素水平可以表明抗肿瘤应答的活性 优于传统的CTL法（很少有假阳性）
为什么白介素12在有的肿瘤治疗模型里如此 有效，但在其他肿瘤治疗模型几乎无效？
对白介素12有无应答的肿瘤模型对比
tumor/strain MCA105/B6 MCA203/B6 MCA205/B6 Sa1/AB6F1 CT-26/CB6F1 MCA101/B6 B16/B6 Lewis lung/B6 Pan02/B6 4T1/CB6F1 immunogenic yes yes yes yes yes no no no no no tumor size (day) 13-17 mm(14) 10-14 mm(14) 9-15 mm(14) 12-22 mm(10-14) 10-13 mm(14) 7-15 mm(10-14) 4-13 mm(7-14) 5-14 mm(7-14) 6-10 mm(14) 5-17 mm(7-12) cure rate 5/5 4/5 4/5 12/15 6/10 0/10 0/10 0/10 0/5 0/10