绿色荧光蛋白gfp标记方法 ppt课件
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纤维素降解菌X-3的GFP标记
1
试验路线
gfp质粒的提取
X-3感受态细胞的制备
gfp质粒+X-3感受态细胞 电击转化
X-3-gfp标记菌
经过传代培养验证其稳定性，同时检测其 相关理化特性（ph，温度，含氧量，转 速等）是否受到影响，确定gfp标记的细 菌可以用于进一步研究
2
GFP标记
菌落观察
油镜观察
6
System
4Biblioteka Baidu
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波加热
至透明倒 入制胶板中 b.2 μl质粒+2 μl单染料滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
3
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
结果，并记录
5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
2.收集生长中期的培养物于冰水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤液冲洗细胞4 次 。具体过程： 用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混 匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重 复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保 持冷却。
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试验路线
gfp质粒的提取
X-3感受态细胞的制备
gfp质粒+X-3感受态细胞 电击转化
X-3-gfp标记菌
经过传代培养验证其稳定性，同时检测其 相关理化特性（ph，温度，含氧量，转 速等）是否受到影响，确定gfp标记的细 菌可以用于进一步研究
2
GFP标记
菌落观察
油镜观察
6
System
4Biblioteka Baidu
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波加热
至透明倒 入制胶板中 b.2 μl质粒+2 μl单染料滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
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本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
结果，并记录
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二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
2.收集生长中期的培养物于冰水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤液冲洗细胞4 次 。具体过程： 用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混 匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重 复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保 持冷却。