常见的生物化学与分子生物学实验

一动物组织蛋白质得提取

【目得要求】1掌握动物组织蛋白质得提取方法。2了解动物组织蛋白质提取得原理。

【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上得差异很大,即或就是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同得体系中,因此不可能有一个固定得程序适用各类蛋白质得分离。但多数分离工作中得关键部分基本手段还就是共同得,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合得蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质.蛋白质在不同溶剂中溶解度得差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团得比例,其次取决于这些基团得排列与偶极矩。故分子结构性质就是不同蛋白质溶解差异得内因.温度、ｐH、离子强度等就是影响蛋白质溶解度得外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要得物质分开。但动物材料中得蛋白质有些以可溶性得形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离.蛋白质中得角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当得溶剂洗去可溶性得伴随物，如脂类、糖类以及其她可溶性蛋白质,最后剩下得就就是不溶性蛋白质.蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物即得粗提取液。

【试剂器材】1实验小鼠20、9ＮaCｌ3动物组织蛋白裂解缓冲液Ｔris 50ｍＭ，ＮａC1150mM ，ＥＤTA ０、5mM ，DTT 1mM ,TriｔoｎＸ—1001,去氧胆酸钠０、5,SDＳ0、14，PＭSF/异丙醇储备液100mM，174mg／1０mｌ于—20℃储存5－2０℃储存得冰块。

【操作步骤】1、颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取０、６g置于含预冷0、９NａＣ16mＬ得平皿中。

２、在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。

3、在预冷得裂解缓冲液中添加PMＳF／异丙醇储备液20?Ｌ／2mＬ。

4、迅速将2mL预冷得裂解缓冲液加入匀浆器中冰浴条件下充分研磨。

5、将组织研磨液转移到1、5mL得离心管中于4℃离心１４００0rpmｌ０ｍin。2

６、离心完毕吸取上清液转移至一新得1、5ml离心管中即为组织蛋白粗提取液。

7、所获蛋白提取液可保存于-２0℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。

【注意事项】

在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态以防蛋白质得降解。

实验二蛋白质得定量Braｄforｄ法

【目得要求】掌握考马斯亮蓝Cｏomassie BrilliaｎｔＢｌｕe法测定蛋白质含量得原理与方法。

【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度就是利用蛋白质与染料结合得原理定量测定微量蛋白质浓度具有快速、灵敏得特点.考马斯亮蓝G—25０存在两种不同得颜色形式红色与蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G25０得结合就是通过范德华力实现得，并且在一定浓度范围内二者得结合显色符合朗伯-比尔定律。结合后得产物在5９5nm处具有最大吸收峰,通过对溶液得光吸收测定，可获得与其结合蛋白质得量。

【试剂器材】1、考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-2５０1０0mg溶于25ｍL甲醇中加入８00mL蒸馏水再加入100ｍＬ85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mＬ滤纸过滤。2、标准蛋白质溶液1mｇ/mＬ牛血清白蛋白1０0ｍg加0、９NaCｌ至100m Ｌ。3、试管及试管架吸管。4、比色计.

【操作步骤】一、标准曲线得制备取5支试管编号按下表操作编号1号液、２号液、3号液、4号液、5号液、标准蛋白质溶液、0mL、０、2０、40、60、81、01mg/ｍＬ、0、9NａClmL、0、80、60、40、2蛋白质浓度2０0、400、600、800、1000ug/ｍL。另取6支试管编号为0５按下表操作编号012345,1号液2号液3号液4号液5号液不同浓度蛋白质溶液mL 0、10、10、10、１0、1 ０、9Na ＣIｍL0、1考马斯亮蓝试剂mＬ555555蛋白质含量ug0３混匀各管室温下静置10分钟,于59５nm处进行比色。

二、绘制标准曲线以A595ｎｍ为纵坐标,标准蛋白质含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。

三、测定未知样品蛋白质浓度测定方法同上取适量未知样品使其测定值在标准曲线得直线范围内。根据所测定得Ａ595nｍ值在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质得量从而计算出未知样品得蛋白质浓度。

【注意事项】1在考马斯亮蓝试剂加入后得520分钟内测定光吸收因为在此段时间内颜色最稳定。2测定中蛋白一染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上实验证明此复合物得吸附量就是可以忽略得测定后可用乙醇将比色杯洗干净。

实验三ＳＤS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

【目得要求】1、了解并掌握SＤS—ＰＡGE电泳原理及方法。2、掌握垂直板电泳得操作方法。

【实验原理】十二烷基硫酸钠SＤS－聚丙烯酰胺凝胶PＡGＥ电泳,可根据蛋白质分子大小得差别分离蛋白质，并可测定蛋白质得相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在得特殊物理效应有关

１凝胶得分子筛效应，聚丙烯酰胺凝胶就是在催化剂得作用下聚合而成得具有网状立体结构得微孔凝胶蛋白质颗粒，在电场中通过此凝胶时会受到阻碍.大分子蛋白质受到得阻力大,电泳速度小,而小分子蛋白质受到得阻力小，移动快。因而最终在凝胶中得以分离。

2电荷效应，ＳＤS就是一种表面活性剂，在蛋白样品与ＰAGE凝胶中加入SＤS则能与蛋白质分子上得疏水基团结合,使蛋白质表面覆盖一层SＤS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有得带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身得电荷差别,使各种SＤS－蛋白质复合物都带有均等密度得负电荷,分子之间得电荷差异消失。

３变性效应，SDS同时还破坏了蛋白质中得非共价键，导致蛋白质变性，使SＤS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似得形状。因此蛋白质在SDS—PAGE凝胶中得电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷与形状得影响,而主要取决于分子量得大小.在进行ＳＤS—PAＧE电泳时同时使用蛋白质分子量标准样品,则可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质得相对分子量。

４凝胶对样品得浓缩效应SDS—PAGE使用一种不连续得缓冲系统即分为低浓度得浓缩胶与较高浓度得分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液得pH值与离子强度也不相同。电泳时样品中得SDS—蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大得浓缩,然后再经过分离胶被分离.SＤＳ－PAGＥ凝胶已经成为实验室常用得蛋白质分离方法,通常被用于蛋白质制品纯度得鉴定与蛋白质分子量得测定.