电子显微镜技术详细介绍

TEM结构和工作原理
镜筒
辅助系统
照明系统： 电子枪、聚光镜
成像系统： 样品室、物镜、 中间镜、投影镜
真空系统： 机械泵、油扩 散泵、真空管 道、阀门等
电源系统： 高压电源等
观察记录系统： 观察室、底片室
水冷系统： 循环水泵等
电子枪
聚光镜 物镜
投影镜
电子束
样品 光栏 荧光屏
TEM成像和工作原理
电子束投射在样品上，部分电 子直接穿透样品产生透射电子
为什么？
快 1分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为
瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。
小 约1mm³的小块，组织块过大其中央得不到及
时固定会发生细胞自溶现象。
轻 不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损
伤。
冷 低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组
织发生自溶。
温度越低越好吗？
－20℃冷冻后
快小
80万倍
成 像 透射电子信号成像
二次电子信号成像
样品制备 超薄切片等，过程复杂 较简单，标本可大而厚
图像特点 二维结构，平面图像 三维结构图像，立体感强
应 用 组织细胞内部超微结构 表面及其断面立体形貌
冷冻电子显微镜 (cryo- electron microscopy)
冷冻电镜技术 （Cryo-Electron Microscopy）
电子显微镜的基本类型
✓透射电子显微镜(sransmission electron microscopy) ✓扫描电子显微镜(scanning electron microscopy) ✓分析电子显微镜 (analytic electron microscopy) ✓高压电子显微镜 (high voltage electron microscopy) ✓冷冻电子显微镜 (cryo- electron microscopy)
电子显微镜技术 （electron microscope）
学习目标
一、电镜的基本理论和分类（熟悉） 二、透射电子显微镜及应用（熟悉） 三、扫描电子显微镜及应用（熟悉） 四、电镜样本的取材（掌握）
二十世纪最主要的发明之一
55年之后， 1986年获诺贝 尔物理学奖
鲁斯卡(左)和他发明的第一台电镜（1932年）
分辨率（resolution）
表示人眼和光学仪器能够辨别两点 之间最小距离的标志。
两点间的距离越小，表示： 分辨率 ？ 仪器所能分清被观察物体的细节 ？
分辨率是衡量电镜性能的重要指标
分辨率（resolution）
人眼分辨率 光镜分辨率 电镜分辨率
0.2毫米（mm） 0.2微米（µm） 0.2毫微米（nm）
单颗粒技术
电子断层成像技术
（Single Particle Technique ） （Electron tomography）
单颗粒技术 （Single Particle Technique ）
单颗粒技术（Single Particle Technique ） 膜蛋白TRPV1颗粒
电子断层成像技术（Electron tomography）
血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体 或死亡后缺氧引起自发性的变化影响。
特别是对脑、心肌、肾脏等对 缺氧比较敏感的组织尤为重要
不同动百度文库、不同组织对灌注中压力和速度的要求不同
灌注压力 灌注流量 （mmHg） （毫升/分）
肾
120～140
9～10
睾丸
200～220
高压冷冻 Cryo-TEM图像分析
冷冻超薄切片
Cryo-TEM 冷冻透射电子显微镜
电子断层成像技术（Electron tomography） Drug loaded liposomes
二、透射电子显微镜（TEM） Transmission Electron Microscopy
（一）透射电子显微镜结构和工作原理 （二）透射电子显微镜的样本制备技术 （三）透射电子显微镜在生物医学领域的应用
显微镜的分辨率与波长的关系？（半波长） 光波波长约 0.4 µm，光镜的分辨率？ 电子波长约 0.005 nm，电镜的分辨率？
放大倍率 ＝人眼分辨率／显微镜分辨率 （magnification）
3.000×
TEM：～150万倍
50×
SEM：～80万倍
TEM
分辨率 0.1nm
SEM
0.6nm
放 大 150万倍
电
子 束
二次电子
透射电子和二次电子
样样本本
透射电子
透射电子（transmission electron）
当样品厚度小于100nm时，部分 电子可穿透样品，将穿透样品的电子 叫做透射电子，利用透射电子信息成 像的称为透射电镜。
二次电子（Second electron）
在入射电子的轰击下，样品表面5 ～50nm深度激发出来的电子称为二次电 子，利用二次电子信息成像的称为扫描 电镜。
3.免疫电镜技术 Immune Electron Microscopy
1. 超薄切片（ultrathin section ）制备技术
超薄切片制备技术 基本操作程序
取材 脱水 修块
预固定 浸透 切片
后固定 包埋聚合 染色
蜡片
取材
快 在1分钟内固定！ 小 1mm³的小块 轻 不要牵拉、锯、挤压组织 冷 低温操作，4℃保存
带有样品信息的透射电子经成 像系统放大，投射到荧光屏上
透射电子多，荧光屏亮；反之
荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与 样品微细结构一一对应，产生具 有一定反差的黑白影像
（二）TEM 的样品制备技术
1. 超薄切片技术 Ultramicrotomy
2. 负染色技术 Negative staining technique
组织未及时固定
轻 血管内皮
预固定
组织块浸泡固定 体内原位固定 血管灌注固定
常用预固定剂：2 .5% 戊二醛
组织块浸泡固定
取2～3块组织迅速浸泡于固定液中
如：肝、脾、肺 1mm3 !
如：胃、肠、皮肤 2mm×1mm2 ！
血管灌注固定
将固定液经血液循环灌流到动物体内,把活细 胞在原位及时固定。
一、电子显微镜的基本理论和分类
电子显微镜以电子射线作为照明光源， 以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍 率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超 微结构。
电子束（electron beam）
又称电子射线 电子束带负电荷 具有光的波动性可折射性 电镜利用电子束作为“光源”成像
电子枪
电子与样品作用后产生的 电子信号主要有：