黄曲霉毒素免疫亲和柱重复利用的探讨_赵丽元

回收率 /% G1
99. 71 97. 10 94. 98 95. 46
B2 98. 44 95. 06 98. 55 96. 91
B1 98. 77 99. 89 96. 61 95. 24
由表 1 可见，亲和柱经过四次试验，回收率的结果无明 泽泻（ 阴性样品） 和泽泻 + 33 ng 黄曲霉毒素（ 阳性样品） 进
中国现代药物应用 2014 年 1 月第 8 卷第 1 期 Chin J Mod Drug Appl，Jan 2014，Vol． 8，No． 1
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黄曲霉毒素免疫亲和柱重复利用的探讨
赵丽元 郝爱鱼 刘英慧
【摘要】 目的 考察中药材类别和亲和柱处理方法对黄曲霉毒素免疫亲和柱重复利用的影响，探 讨亲和柱重复利用的可能性。方法 通过在不同中药材中加入黄曲霉毒素对照品，经免疫亲和柱净化HPLC-柱后光衍生分析，考察亲和柱重复利用后的回收率； 考察不同的亲和柱处理方法对回收率的影响。 结果 中药材类别对免疫亲和柱重复利用的影响差异很大，部分种子类中药材使用后亲和柱重复利用 3 次回收率无明显变化，部分根茎类使用后，亲和柱回收率降低明显，特别是 G2 更易受影响。亲和柱处理 时有机溶剂，空气暴露和复性时间均可影响柱子重复利用。结论 中药材类别和处理方法对黄曲霉毒 素免疫亲和柱的重复利用均有显著影响。
基金项目： 大连市科技计划基金项目（ 项目编号： 2011E15SF121） 作者单位： 116021 大连市食品药品检验所 通讯作者： 赵丽元 E-mail： liyuan0422@ sohu． com
元范围内。由于此免疫亲和柱为一次性使用，不建议重复使 用，因此一份样品的检验成本就要近 200 元，对于一般的实 验室或将进行黄曲霉素的深入研究的实验室，检验或科研成 本将大大增加，从而限制了黄曲霉毒素的研究工作的开展。 本文选用了使用最广泛的美国 VICAM 公司的 AflaTest@ P 免 疫亲和柱为研究对象，对其重复利用的影响因素进行研究。 1 仪器与试药
【关键词】 黄曲霉毒素； 免疫亲和柱； 回收率； 重复利用
Study on repeated usings of aflatoxins immunoaffinity columns ZHAO Li-yuan，HAO Ai-yu，LIU Yinghui． Dalian Institute for Food and Drug Control，Dalian 116021，China
2695e 高效液相色谱仪； 光衍生器 UVE（ LC Tech 公司） ； 黄曲霉毒素混合对照品（ Supelco 公司； 批号： LB82382） ； 免疫 亲和柱（ AflaTest@ P，1 mL，VICAM 公司） 。 2 方法 2. 1 供试品溶液的制备 供试品溶液制备方法参考《中国 药典》2010 年版一部。PBS 缓冲液： 2. 9 g Na2 HPO4 ·12H2 O + 0. 27 g KH2 PO4 + 0. 2 g KCl + 8. 0 g NaCl 用超纯水溶解 至 1000 ml，调节 pH 值至 7. 4，加热煮沸，冷却待用。 2. 2 使用过的免疫亲和柱的处理方法 使用过的免疫亲和 柱用 5 ml 水洗，5 mlPBS 缓冲液过柱，洗后用 PBS 缓冲液填 充柱子，室温放置 1 ～ 2 h 后，置 2 ～ 8℃ 冰箱内放置过夜。 2. 4 色谱条件 用 Zobax SB-C18 色谱柱，以乙腈-甲醇-水为 流动相，梯度洗脱。 3 结果 3. 1 无基质干扰时亲和柱重复利用情况 取黄曲霉毒素对 照品 33 ng（ 黄曲霉毒素 B1 12. 5 ng） ，用水稀释成甲醇浓度 14% 的溶液作为样品溶液，进行回收试验，重复使用 4 次，结 果见表 1。
显差异，仍在 90% 以上，由此可见，在药材干扰的情况下，亲 行考察，结果见表 2 和 3。第一次： 制备阴性中药材和阳性中
和柱可重复使用 4 次。
药材使用一次后的亲和柱； 第二次： 均加入泽泻 + 33 ng 黄曲
3. 2 不同中药材使用后亲和柱重复利用情况
霉毒素考察回收率； 第三次： 均加入泽泻 + 33 ng 黄曲霉毒素
3. 2. 1 阴性与阳性中药材使用后亲和柱重复利用情况 取 考察回收率。
表 2 阴性样品回收试验结果
使用次数
第一次 第二次 第三次
总量 0
82. 38 64. 01
G2 0 16. 24 3. 71
回收率 /% G1 0
89. 78 74. 74
B2 0 86. 83 57. 26
B1 0 100. 86 89. 56
【Key words】 Aflatoxin； Immunoaffinity columns； Ｒecoveries； Ｒepeated usings
免疫亲和柱是 20 世纪 90 年代在分析领域得到应用的 一种新技术，它是将一定量的单克隆抗体偶联在合适的担体 上，制成相应的免疫亲和柱。该柱具有高选择性吸附和抗干 扰的特性，净化效果好，检测灵敏度高，是目前国际上较为常 用的检 测 真 菌 毒 素 样 品 前 处 理 方 法 之 一［1］。《中 国 药 典》 2010 年版一部［2］、《欧洲药典》7. 0［3］、GB / T 18979-2003［4］中 均采用该方法进行黄曲霉毒素的测定。随着《中国药典》中 收载需检测黄曲霉毒素的中药材和制剂的品种的增加，以及 中药中黄曲霉毒素 残 留 研 究 的 深 入［5-9］ ，免 疫 亲 和 柱 的 使 用 将会越来越广泛。但从文献报道来看，免疫亲和柱的使用条 件和回收处理条件研究并不是很多。仅有王莹等［1］人对 M1 免疫亲和柱的制备及使用条件进行了优化； 李佩暖等［10］ 人 对黄曲霉毒素前处理方法进行了优化； 李卫岗等［11］ 人重复 使用了 3 次无明显影响。以上文章是以牛奶和花生为样品 对黄曲霉毒素免疫亲和柱前处理方法进行的研究，未见有人 以中药材为样品对黄曲霉毒素免疫亲和柱的回收纯化及重 复利用进行研究，本文即以中药材为样品对黄曲霉毒素免疫 亲和柱的重复利用的影响因素进行研究。目前，黄曲霉毒素 免疫亲和柱的生产厂家较少，美国 VICAM，德国 LC-Tech 及 北京华安麦科生物技术有限公司为较常见，价格在 100 ～ 200
表 3 阳性样品回收试验结果
使用次数
第一次 第二次 第三次
总量98. 59 79. 19 63. 92
G2 98. 21 22. 47 4. 08
回收率 /% G1
94. 89 87. 08 71. 13
B2 98. 06 86. 73 59. 74
B1 98. 78 91. 72 88. 92
由表 2 和表 3 可见，亲和柱经过三次试验，无论是阴性 分析原因可能是泽泻中某些物质对亲和柱中抗体造成破坏 样品柱还是阳性样品柱，回收率的结果无明显差异，黄曲霉 或抑制其结合，因此作者进行不同的中药材亲和柱重复利用 毒素总量第二次使用后回收率为 82. 4% 和 79. 2% ，第三次 的考察。 使用后回收率为 64. 0% ，63. 9% ，因此中药材中是否含有黄 3. 2. 2 种子类中药材亲和柱重复利用情况 选取容易产生 曲酶毒素不是影响亲和柱回收利用的主要因素。从结果可 黄曲霉毒素的种子类中药材杏仁，薏苡仁和柏子仁进行亲和 见，黄曲霉毒素的回收率随着使用次数的增加在逐渐降低， 柱的回收情况的考察，每份样品中同时加入 33 ng 黄曲霉毒 特别是 G2 回 收 率 降 低 明 显，第 二 次 使 用 后 回 收 率 降 低 至 素对照品进行回收，结果见表 4。 16. 2% 和 22. 5% ，第三次使用后回收率降低至 3. 7% ，4. 1% 。
【Abstract】 Objective To investigate the influence of categories of traditional Chinese medicinal materials and treatment methods on repeated usings of immunoaffinity columns in determination of aflatoxins，and study the possibility of repeated usings． Methods The different samples including aflatoxins control substance were analyzed by the immunoaffinity column purification coupled with HPLC and post-column fluorescence detection，and recoveries were obtained after repeated usings of immunoaffinity columns． At the same time we studied on recoveries in different treatment methods of immunoaffinity columns． Ｒesults The influence of categories of traditional Chinese medicinal materials on repeated usings of immunoaffinity columns is very large． Some immunoaffinity columns aftering purificating seed species Chinese medicinal materials can be reused three times with high recovery，some rhizoma species with reducing recoveries significantly，especially the recovery of G2. Organic solvent，air exposure and renaturation tione can effect the repeated usings of immunoaffinity columns． Conclusion Categories of traditional Chinese medicinal materials and treatment methods have a significant effect on repeated usings of immunoaffinity columns in determination of aflatoxins．