干细胞及成体细胞
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
16
分离方法
（一）差速贴壁法
约24h后
全骨髓标本 脂肪、皮肤
培养
未黏附细胞：造血干细胞、 造血后代细胞 黏附细胞：即为MSC呈纺锤形
骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上的细胞，贴壁生长的细胞中 95~98%为MSC。根据细胞表面抗原获得MSC。
35
（二）密度梯度离心法
利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力
（2）来源于成体—— 成体组织来源的干细胞 ASC（Adult Stem Cell ） 是指那些分布在成体组织中尚未分化的、具有自我 更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞 潜能的干细胞，又称为组织特异性干细胞（Tissuespecific stem cell）。 它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再 生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程 序分化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生 长和衰退的动态平衡。如：神经干细胞，表皮干细 胞。
（1）流式细胞分选
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单 细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高 速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。 原理：使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒 逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转 换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度 的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图 和加三维结构图像进行分析。
造血干细胞的分离纯化
根据造血干细胞的表面标志，可通过免疫细胞化学、 流式细胞仪、分子杂交和PCR等多种细胞生物学和 分子生物学手段来检测造血干细胞。现大多仍然基于 对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞。 方法：密度梯度离心、拒染和抗原标志物进行密度梯 度离心、流式细胞分选、免疫磁珠分离、平面黏附分 离等
三、癌症治疗
研究人员正试图设计多种方法，使特定细胞能击中 特定癌细胞，直接破坏或改变癌细胞。
干细胞技术及其应用前景
干细胞的研究史
1996 年 7 月 5 日，苏格兰爱丁堡 市郊的罗斯林研究所应用细胞 核转移技术克隆了一头大个儿 羊羔，伊恩·威尔默特以著名 乡村歌手多利·帕顿的名字命 名这头羊。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
2
细胞核转移技术
3
第一节 概 述
一、干细胞的定义
• 干细胞（stem cell）是一类具有自我更新能力和 多向分化潜能的未分化或低分化原始细胞群体，也 称为“万能细胞”。 • 通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大， 细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性， 不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定 干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。
2．基因治疗。即通过胚胎干细胞和基因工程技术， 矫正缺陷基因。 因干细胞能自我复制更新，是基因治疗的理想靶细胞。 将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中， 能够持久地发挥作用，而不担心像分化的细胞那样， 在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。
二、基础研究
1．利用干细胞研究解释先天缺陷的产生原因和防治 方法。 2．将发育生物学与干细胞生物学相关联，研究干细 胞生长与分化的遗传控制与环境条件等，便于在实验 室中进行干细胞的培养和分化。
干细胞的分裂方式
干细胞有对称与不对称两种分裂方式。 • 不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为早起祖 细胞；另一个保持干细胞的特征。 • 意义： ①使机体对干细胞的调控更灵活，以适应机体的生 理变化。 ②要求机体对干细胞分裂的调控更精确，以保持干 细胞数目恒定。
二、干细胞的分化特征
（一）按其分化潜能的大小，干细胞可分为三类： 一是全能干细胞，二是多能干细胞，三是单能干细 胞。 （1）全能干细胞（totipotent stem cells） 指具有分化为组成生命个体所有类型细胞能力的 细胞。如：胚胎干细胞 （2）多能干细胞（pluripotent stem cell ） 指具有产生多种类型分化细胞的能力，但失去发 育为完整个体的能力的一类干细胞，即只能分化 成特定组织或器官等特定族群的细胞。如：骨髓 造血干细胞
•
第三节 干细胞的应用研究
一、移植研究—恢复器官功能
1．细胞治疗。 干细胞可恢复因重大疾病而损害的细胞，这是干细 胞潜在的最大优势。 由于丧失正常细胞功能的疾病都可以通过移植由胚 胎干细胞分化来的特异组织细胞来治疗。 因为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，无法靠 自身得到修复。可以用人体胚胎干细胞能直接分化 成相应细胞进行移植。
造血干细胞的检测方法
确认小鼠造血干细胞的唯一标准仍然是多年来一直沿 用的长期体内重建造血能力（Long-term repopulation, LTR）检测。 绵羊子宫内胎羊移植系统。该系统是在胎羊免疫系统发育 前于子宫内将造血细胞移植给胚胎羊，在小羊出生后，通 过追踪其体内不同血细胞系的分布和比例来判断移植的造 血干细胞是否具有长期重建多系造血的能力
MSC的主要分离手段 差速贴壁法
MSC在低血清培养基中具贴壁优势特性，
定期换液除去不贴壁细胞，可纯化及扩增MSC
密度梯度离心法
根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞 进行贴壁培养
流式细胞仪法、免疫磁珠法
流式或磁珠分选后的细胞出现增殖缓慢，成本较高、
技术难度较大，限制了这些方法的广泛应用
（2）免疫磁珠分离
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接 有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过 抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无 该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异 性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使 细胞得以分离。
免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法： 阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细 胞为所需细胞 一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大， 阳性分离法用行更多。
二、间充质干细胞
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC） 是指中胚层来源的具有多向分化潜能的一类多能型 干细胞的统称。 来源：个体发育中的骨髓腔 通过流式细胞仪分析，特异性表面抗原有：SH2、 SH3、CD90、CD71、CD44等。
分化潜能
间充质干细胞可分化为多种间充质组织
（3）诱导性多能干细胞（ induced pluripotent stem cell ，iPSC） 来源于终末分化的体细胞，通过重编程，逆向转变 为多能的干细胞。
15
第二节 成体干细胞的分离培养
一、成体干细胞的来源
• 骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙 髓、肝脏、皮肤、胃肠道上皮、胰腺和脂肪 • 特点：多向分化、自我更新、可塑性
二、干细胞的增殖特征
1.增值缓慢性 (1)利于干细胞对外界信号作出反应，以决定细胞的发 展方向—增殖或分化。 (2)减少基因突变的危险。增殖缓慢使干细胞有时间发 现并纠正处于增殖周期过程中的错误。 2.自稳定性 指干细胞可在个体生命过程中自我更新并维持其自身 数目恒定。 干细胞通过其特有的分裂方式维持自稳定性。
一、造血干细胞
• 造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC）指 具有自我更新能力和多向分化潜能的最原始的造血细 胞。 • 造血干细胞的来源：骨髓、外周血、脐带血、胎儿造 血系统。
不同来源造血干细胞的比较：
造血干细胞的表面标志
人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38－、 Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、 CD45RA－、CD71－等。人类造血干细胞还对5氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。 表面标志比较多，临床上应用最多的是CD34。 还可与激酶插入区域受体KDR(kinase insert domain recepter)配合鉴定造血干细胞和造血祖 细胞。 造血干细胞：CD34+KDR+ 造血祖细胞： CD34+KDR-
作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同
区域上形成区带的方法。
MSC的应用
由于间充质细胞在体外可以相对容易地诱导出骨 细胞、软骨细胞，可在骨损伤、先天性骨畸形有 治疗中有广泛应用。 分离方便、扩增迅速。可研究在分化过程中信号 转导系统、基因表达的差异等，为进一步阐明其 中的分化机理奠定基础.
成体干细胞的优点： （1）获取相对容易； （2）源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织 性相容的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制 剂； （3）胚胎干细胞分化具有“非定位性”，目前，尚不 能控制胚胎干细胞在特定部位分化成相应的细胞，容 易导致畸胎瘤。理论上，成体干细胞致瘤风险低，所 受伦理学争议较少； （4）成体干细胞也具有类胚胎干细胞的多向分化潜能。
（3）单能干细胞（multipotent stem cell ） 也叫专能、偏能干细胞，指除了自我复制外，只能分 化为一种类型子代类型的一类细胞。如肌肉中的成肌 细胞等。
全能干细胞
多能干细胞
单能干细胞
10
受精卵
胚胎（5-7天） 胚胎
胎组织
成人
11
（二）根据干细胞的来源，可分为胚胎干细胞、成体 干细胞、其他诱导多能干细胞。 （1）来源于胚胎—— 胚胎干细胞ESC（Embryonic Stem Cell ） 指来源于哺乳类动物胚胎发育早起囊胚期内细胞团细 胞，在体外培养条件下，具有体外无限复制和分化为 体内任何种类细胞的潜能。如：ES细胞、EG细胞、 EC细胞等。
分离方法
（一）差速贴壁法
约24h后
全骨髓标本 脂肪、皮肤
培养
未黏附细胞：造血干细胞、 造血后代细胞 黏附细胞：即为MSC呈纺锤形
骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上的细胞，贴壁生长的细胞中 95~98%为MSC。根据细胞表面抗原获得MSC。
35
（二）密度梯度离心法
利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力
（2）来源于成体—— 成体组织来源的干细胞 ASC（Adult Stem Cell ） 是指那些分布在成体组织中尚未分化的、具有自我 更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞 潜能的干细胞，又称为组织特异性干细胞（Tissuespecific stem cell）。 它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再 生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程 序分化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生 长和衰退的动态平衡。如：神经干细胞，表皮干细 胞。
（1）流式细胞分选
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单 细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高 速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。 原理：使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒 逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转 换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度 的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图 和加三维结构图像进行分析。
造血干细胞的分离纯化
根据造血干细胞的表面标志，可通过免疫细胞化学、 流式细胞仪、分子杂交和PCR等多种细胞生物学和 分子生物学手段来检测造血干细胞。现大多仍然基于 对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞。 方法：密度梯度离心、拒染和抗原标志物进行密度梯 度离心、流式细胞分选、免疫磁珠分离、平面黏附分 离等
三、癌症治疗
研究人员正试图设计多种方法，使特定细胞能击中 特定癌细胞，直接破坏或改变癌细胞。
干细胞技术及其应用前景
干细胞的研究史
1996 年 7 月 5 日，苏格兰爱丁堡 市郊的罗斯林研究所应用细胞 核转移技术克隆了一头大个儿 羊羔，伊恩·威尔默特以著名 乡村歌手多利·帕顿的名字命 名这头羊。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
2
细胞核转移技术
3
第一节 概 述
一、干细胞的定义
• 干细胞（stem cell）是一类具有自我更新能力和 多向分化潜能的未分化或低分化原始细胞群体，也 称为“万能细胞”。 • 通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大， 细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性， 不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定 干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。
2．基因治疗。即通过胚胎干细胞和基因工程技术， 矫正缺陷基因。 因干细胞能自我复制更新，是基因治疗的理想靶细胞。 将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中， 能够持久地发挥作用，而不担心像分化的细胞那样， 在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。
二、基础研究
1．利用干细胞研究解释先天缺陷的产生原因和防治 方法。 2．将发育生物学与干细胞生物学相关联，研究干细 胞生长与分化的遗传控制与环境条件等，便于在实验 室中进行干细胞的培养和分化。
干细胞的分裂方式
干细胞有对称与不对称两种分裂方式。 • 不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为早起祖 细胞；另一个保持干细胞的特征。 • 意义： ①使机体对干细胞的调控更灵活，以适应机体的生 理变化。 ②要求机体对干细胞分裂的调控更精确，以保持干 细胞数目恒定。
二、干细胞的分化特征
（一）按其分化潜能的大小，干细胞可分为三类： 一是全能干细胞，二是多能干细胞，三是单能干细 胞。 （1）全能干细胞（totipotent stem cells） 指具有分化为组成生命个体所有类型细胞能力的 细胞。如：胚胎干细胞 （2）多能干细胞（pluripotent stem cell ） 指具有产生多种类型分化细胞的能力，但失去发 育为完整个体的能力的一类干细胞，即只能分化 成特定组织或器官等特定族群的细胞。如：骨髓 造血干细胞
•
第三节 干细胞的应用研究
一、移植研究—恢复器官功能
1．细胞治疗。 干细胞可恢复因重大疾病而损害的细胞，这是干细 胞潜在的最大优势。 由于丧失正常细胞功能的疾病都可以通过移植由胚 胎干细胞分化来的特异组织细胞来治疗。 因为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，无法靠 自身得到修复。可以用人体胚胎干细胞能直接分化 成相应细胞进行移植。
造血干细胞的检测方法
确认小鼠造血干细胞的唯一标准仍然是多年来一直沿 用的长期体内重建造血能力（Long-term repopulation, LTR）检测。 绵羊子宫内胎羊移植系统。该系统是在胎羊免疫系统发育 前于子宫内将造血细胞移植给胚胎羊，在小羊出生后，通 过追踪其体内不同血细胞系的分布和比例来判断移植的造 血干细胞是否具有长期重建多系造血的能力
MSC的主要分离手段 差速贴壁法
MSC在低血清培养基中具贴壁优势特性，
定期换液除去不贴壁细胞，可纯化及扩增MSC
密度梯度离心法
根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞 进行贴壁培养
流式细胞仪法、免疫磁珠法
流式或磁珠分选后的细胞出现增殖缓慢，成本较高、
技术难度较大，限制了这些方法的广泛应用
（2）免疫磁珠分离
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接 有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过 抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无 该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异 性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使 细胞得以分离。
免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法： 阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细 胞为所需细胞 一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大， 阳性分离法用行更多。
二、间充质干细胞
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC） 是指中胚层来源的具有多向分化潜能的一类多能型 干细胞的统称。 来源：个体发育中的骨髓腔 通过流式细胞仪分析，特异性表面抗原有：SH2、 SH3、CD90、CD71、CD44等。
分化潜能
间充质干细胞可分化为多种间充质组织
（3）诱导性多能干细胞（ induced pluripotent stem cell ，iPSC） 来源于终末分化的体细胞，通过重编程，逆向转变 为多能的干细胞。
15
第二节 成体干细胞的分离培养
一、成体干细胞的来源
• 骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙 髓、肝脏、皮肤、胃肠道上皮、胰腺和脂肪 • 特点：多向分化、自我更新、可塑性
二、干细胞的增殖特征
1.增值缓慢性 (1)利于干细胞对外界信号作出反应，以决定细胞的发 展方向—增殖或分化。 (2)减少基因突变的危险。增殖缓慢使干细胞有时间发 现并纠正处于增殖周期过程中的错误。 2.自稳定性 指干细胞可在个体生命过程中自我更新并维持其自身 数目恒定。 干细胞通过其特有的分裂方式维持自稳定性。
一、造血干细胞
• 造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC）指 具有自我更新能力和多向分化潜能的最原始的造血细 胞。 • 造血干细胞的来源：骨髓、外周血、脐带血、胎儿造 血系统。
不同来源造血干细胞的比较：
造血干细胞的表面标志
人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38－、 Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、 CD45RA－、CD71－等。人类造血干细胞还对5氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。 表面标志比较多，临床上应用最多的是CD34。 还可与激酶插入区域受体KDR(kinase insert domain recepter)配合鉴定造血干细胞和造血祖 细胞。 造血干细胞：CD34+KDR+ 造血祖细胞： CD34+KDR-
作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同
区域上形成区带的方法。
MSC的应用
由于间充质细胞在体外可以相对容易地诱导出骨 细胞、软骨细胞，可在骨损伤、先天性骨畸形有 治疗中有广泛应用。 分离方便、扩增迅速。可研究在分化过程中信号 转导系统、基因表达的差异等，为进一步阐明其 中的分化机理奠定基础.
成体干细胞的优点： （1）获取相对容易； （2）源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织 性相容的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制 剂； （3）胚胎干细胞分化具有“非定位性”，目前，尚不 能控制胚胎干细胞在特定部位分化成相应的细胞，容 易导致畸胎瘤。理论上，成体干细胞致瘤风险低，所 受伦理学争议较少； （4）成体干细胞也具有类胚胎干细胞的多向分化潜能。
（3）单能干细胞（multipotent stem cell ） 也叫专能、偏能干细胞，指除了自我复制外，只能分 化为一种类型子代类型的一类细胞。如肌肉中的成肌 细胞等。
全能干细胞
多能干细胞
单能干细胞
10
受精卵
胚胎（5-7天） 胚胎
胎组织
成人
11
（二）根据干细胞的来源，可分为胚胎干细胞、成体 干细胞、其他诱导多能干细胞。 （1）来源于胚胎—— 胚胎干细胞ESC（Embryonic Stem Cell ） 指来源于哺乳类动物胚胎发育早起囊胚期内细胞团细 胞，在体外培养条件下，具有体外无限复制和分化为 体内任何种类细胞的潜能。如：ES细胞、EG细胞、 EC细胞等。