实验6-α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

有
和
。
水果组织软化及细胞受损 95%乙醇 提高果胶酶的稳定性 固定化的方法 固定化所用的介质
扩展：固定化酶的制备原则
1.维持酶的催化活性和专一性。 2.酶与载体必须结合牢固。 3.载体必须有一定的机械强度。 4.载体稳定，不能与底物或产物发生化学反应。 5.固定化酶的成本要低，以利于工业使用。 6.固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近
固定化酶制备方法比较
吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法
制备难易 结合程度
酶活力 底物专一性
再生 固定化成本
易 弱 高 不变 可能 低
易 强 高 不变 不可能 低
难 强 低 可变 不可能 高
难 强 中等 可变 不可能 中等
固定化方法
常用载体选择
吸附法
活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( ºC )
固定化酶活性下降
大多数酶固定化后，酶活性下降。活力下降的 原因： ①酶活性中心的重要氨基酸残基与载体相结合。 ②酶与载体结合引起酶的空间结构发生了变化。 ③酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。
什么是固定化酶
固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某 种非水溶性介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的 制剂。
游离酶
酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶的优点
①能提高酶的稳定性。 ②可以反复多次使用，大大降低生产成本。 ③反应后易于与产物分离，利于提高产品质量。 ④反应条件易于控制，生产可实现连续化和自 动化。
固定化酶底物专一性改变
固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位 阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底 物难于接近酶分子而使催化速率大大降低，而分子 量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影 响，故与游离酶的作用没有显著不同。
固定化酶的应用
固定化细胞
固定化细胞：固定在载体上并在一定空间范围内进 行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。
固定化原生质体
注意：一般要添加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。 ①由于去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧气和营养物 质的传递和吸收和胞内产物的分泌。 ②原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的 保护作用，稳定性提高，可反复使用和连续使用较长的 时间，利于连续化生产。 ③易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高 产品质量。
Step3：固定化柱的保存
用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱（洗去残留的反应物和产 物），放置在4℃冰箱中保存，几天后取出再重复实验。
实验结果
水
淀粉溶液 淀粉滤液 稀释1倍
①
②
③
④
蓝色
红色
浅红色
对照：淡黄色
实验结论：淀粉被α -淀粉酶水解成为糊精。
例题：（2019年·4月浙江选百度文库）回答与果胶和果胶酶有
凝胶包埋法
半透膜包埋法
包埋法：将酶包埋在凝胶网格或半透膜微囊里。 缺点：只适合作用于小分子底物的酶。
交联法
戊二醛
交联法：利用双功能试剂把酶分子彼此交叉连接起来， 形成网络结构。 缺点：反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶 活力损失较大。
双重固定法
实验原理
（1）用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度 的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。 （2）用淀粉指示剂溶液（KI-I2溶液）测试，流出物呈 红色表明水解产物糊精生成。
Hope
多思 多问 多学
α-淀粉酶
淀粉
β-淀粉酶
糊精
糖化淀粉酶
麦芽糖
葡萄糖
遇碘显蓝色
遇碘显红色
遇碘不显色
固
定
化
酶
柱
分布着小
孔的筛板
酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以通过
实验设备及用品
注 射 器
注 射 器 架
阀门
5mL塑料注射器、 50mL烧杯、滴管、自行车用气门心 和夹子、注射器架、试管及微量离心管3支。
Step1：α-淀粉酶的固定化
吸附有α-淀粉 酶的石英砂
控制流速
①吸附：在烧杯中将5 mg α-淀粉酶溶于4 mL蒸馏水中。 再加入5g石英砂，搅拌30min。
②装柱
③洗柱
注
固
射
定
器
化
架
阀门
酶
柱
控制流速
②装柱：装入下端接有气门心并用夹子封住的注射器中。 ③洗柱：用10倍柱体积的蒸馏水洗涤，除去未吸附的游离 淀粉酶。
Step2：淀粉水解作用的检测
①溶解淀粉：50 mg 可溶性淀粉溶于100 mL热水 中，搅拌均匀。 ②过柱：使淀粉溶液以0.3 mL/min的流速过柱， 在流出5mL淀粉溶液后接收0.5 mL流出液。 ③检测：加入1-2滴KI-I2溶液，观察颜色变化。 用水稀释1倍后再观察颜色。
固 定 化 酶 柱
淀粉完全水解？
每分钟6滴
控制流速：让淀粉和淀粉酶充分接触反应。
第二章 酶的应用
实验6：α-淀粉酶的固定化及淀粉水 解作用的检测
什么是酶制剂
胃蛋白酶
蛋白酶和脂肪酶
酶制剂：含有酶的制品。
游离酶的使用
稳定性差 酶无法回收 加热灭酶
蒸汽→
酶解罐简易图
游离酶的缺点
通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常 敏感，容易失活（酶的稳定性差）。 反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量（产 物的分离纯化困难）。 溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了 生产成本（回收困难，一次性使用）。
凝胶包埋法 半透膜包埋法
天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶 合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂
聚酰胺膜、火棉胶膜
交联法
交联试剂：戊二醛、己二胺
共价偶联法 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶
固定化酶稳定性提高
①对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。 ②保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长的 时间。 ③对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。 ④对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和 盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高 的酶活力等。
。果汁
生产中的残渣果皮等用于果胶生产，通常将其提取液浓
缩后再加入
使之形成絮状物，然后通过离心、真
空干燥等步骤获得果胶制品。
（4）常用固定化果胶酶处理含果胶的污水，其主要优点
有
和可连续处理等。在建立和优化固定化果
胶酶处理工艺时，除考虑果胶酶的活性和用量、酶反应
的温度、pH、作用时间等环境因素外，还需考虑的主要
关的问题：
（1）通常从腐烂的水果上分离产果胶酶的微生物，其
原因除水果中果胶含量较高外，还因为
。
（2）为了获得高产果胶酶微生物的单菌落，通常对分
离或诱变后的微生物悬液进行
。
腐烂的水果中含产果胶酶的微生物较多 涂布分离或划线分离
（3）在某种果汁生产中，用果胶酶处理显著增加了产量
，其主要原因是果胶酶水解果胶使
酶的固定化方法
① 吸附法 ③
交联法
②
④ 包
埋
法
共价偶联法
介质
吸附法
吸附法 VS 共价偶联法
吸附法：利用固体吸附剂将酶吸附在其表面。 缺点：酶与载体结合不牢固，容易脱落。 优点：操作简单，条件温和，酶活力损失少。
共价偶联法
共价偶联法：将酶与介质通过共价键连接。 优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落。 缺点：反应条件较激烈，会影响酶的空间构象而影响 酶的催化活性。