重组GAD清酒酵母合成GABA条件优化与稳定

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gaba(γ-氨基丁酸)生物合成路径

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酿酒酵母DL28转化产γ-氨基丁酸主要影响因子的筛选

酿酒酵母DL28转化产γ-氨基丁酸主要影响因子的筛选

酿酒酵母DL28转化产γ-氨基丁酸主要影响因子的筛选乌云达来;郭雪娜;张博润;王肇悦【摘要】[目的]筛选出对酿酒酵母重组菌转化产生γ-氨基丁酸(GABA)具有影响的主要因素.[方法]利用Plackett-Burman试验设计对谷氨酸脱羧酶基因(GAD1)高效表达重组菌Saccharomyces cerevisiae D128转化产GABA的主要影响因子,如菌体浓度、底物浓度、转化温度、转速、转化时间及起始pH等进行研究,筛选出主要影响因素.[结果]试验表明,菌体浓度(P =0.012 3)、转化时间(P=0.0475)及起始pH(P=0.001 9)对转化产生GABA具有显著影响.[结论]研究可为进一步优化菌株DL28产GABA转化条件提供理论依据与实践基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)023【总页数】4页(P258-260,263)【关键词】酿酒酵母;γ-氨基丁酸;发酵条件;影响因素;筛选【作者】乌云达来;郭雪娜;张博润;王肇悦【作者单位】内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特010018;中国科学院微生物研究所,北京100101;中国科学院微生物研究所,北京100101;中国科学院微生物研究所,北京100101;中国科学院微生物研究所,北京100101【正文语种】中文【中图分类】S509.9γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)简称 GABA,是谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15)生物催化L-谷氨酸或钠盐α-羧基脱羧反应而产生的非蛋白质组成的天然氨基酸[1-2],为哺乳动物中枢神经系统的一种主要的抑制性神经递质[3],广泛存在于从单细胞生物到哺乳动物的各种有机体活细胞中[4],具有许多重要的生理功能,如降血压[5]、镇痛[6]、治疗哮喘[7]等。

近年来,GABA 相关功能性食品的开发引人关注,其中植物富集法(米胚、米糠、绿茶等)和微生物发酵法(乳酸菌、酵母)制得的富含GABA食品都获得了良好的社会价值和经济效益。

酵母菌发酵生产糙米酵素条件优化的研究

酵母菌发酵生产糙米酵素条件优化的研究

酵母菌发酵生产糙米酵素条件优化的研究侯利娟;邱志超;王俊玲;唐富丽;刘丹;王春雨;宋金潞;张慧娟【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2016(007)015【摘要】Production technology of brown rice enzyme fermented by saccharomycetes was studied, γ- aminobutyric acid (GABA) was enriched through soaking and anaerobic treatment with brown rice. Protease and γ- aminobutyric acid (GABA) content were taken as the indicator, brown rice enzyme fermented by using saccharomycetes has provided a theoretical basis for manufacturing technique of brown rice enzyme.%对酵母菌发酵糙米酵素的生产工艺进行了研究,通过浸泡和厌氧处理糙米,富集其中的γ-氨基丁酸(GABA)。

以蛋白酶活和γ-氨基丁酸(GABA)含量为指标,利用酵母菌发酵生产糙米酵素,为糙米酵素生产工艺提供理论依据。

【总页数】2页(P6-7)【作者】侯利娟;邱志超;王俊玲;唐富丽;刘丹;王春雨;宋金潞;张慧娟【作者单位】吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101;吉林农业科技学院生物工程学院,吉林吉林 132101【正文语种】中文【中图分类】TS210.9;TQ920.6【相关文献】1.有色糙米酵素发酵工艺条件研究 [J], 袁周率;苏小军;廖晰晰;许静雅;郭时印2.糙米酵素混菌发酵工艺优化 [J], 张旭普;白俊岩;刘腾云;吴荣荣;程书梅3.不同发酵条件对糙米酵素中活性成分的影响 [J], 李飞;隋新;苏红;代娇阳;刘佳;张国峰4.酵母菌发酵制备葛根酵素的工艺优化 [J], 朱德艳5.糙米酵素发酵工艺条件的研究 [J], 李志江;牛广财;鹿保鑫;李兴革;左锋;李雷刚因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

重组蛋白质稳定性的保护与优化技术

重组蛋白质稳定性的保护与优化技术

重组蛋白质稳定性的保护与优化技术蛋白质是生物体内重要的功能分子,常用于制药、农业和生物工程等领域。

然而,蛋白质的稳定性一直是一个重要的挑战,因为它们容易受到环境的影响而失活或降解。

为了克服这个问题,科学家们开发了一系列技术来保护和优化重组蛋白质的稳定性。

一种常用的技术是改变蛋白质的氨基酸序列,以提高其稳定性。

这可以通过替换易受到蛋白质降解酶作用的特定位点上的氨基酸,或者增加具有保护性的氨基酸残基来实现。

例如,研究人员曾经成功地使用天冬酰胺(Proline)替代易降解的苯丙氨酸(Phenylalanine)残基,从而增加了蛋白质的稳定性。

此外,还可以添加二硫键、引入稳定性较高的蛋白质结构域等方法来改善蛋白质的稳定性。

另一种保护蛋白质稳定性的技术是通过改变环境条件来创造一个有利于蛋白质稳定的环境。

其中最常见的方法是使用保护剂和稳定剂。

保护剂,如甘油、蔗糖和聚乙二醇等,可以在蛋白质溶液中形成保护性的层,降低蛋白质的失活率。

稳定剂,如甲醇和丙醇等,可以增加蛋白质与水分子之间的相互作用,提高蛋白质的稳定性。

此外,调节pH值、离子浓度和温度等环境参数也是一种常用的方法来优化蛋白质的稳定性。

除了上述方法,重组蛋白质的稳定性还可以通过加工和储存技术来保护。

例如,冷冻干燥(冻干)是一种常见的保护蛋白质的方法,它通过去除水分来防止蛋白质的降解和失活。

此外,封装和微胶囊化技术也可以用来保护蛋白质,这样可以形成一个稳定的包裹层,防止蛋白质与外部环境接触。

此外,正确的储存条件和容器选择也对蛋白质的稳定性有重要影响。

虽然已经有多种技术可以用来保护和优化重组蛋白质的稳定性,但是每种技术都有其局限性和适用范围。

因此,科学家们仍然在不断努力寻找更好的方法来提高蛋白质的稳定性。

未来的发展趋势之一是利用蛋白质工程技术来设计和开发更稳定的蛋白质。

蛋白质工程可以通过改变蛋白质的结构和性质,进一步提高蛋白质的稳定性。

例如,可以利用计算机模拟和分子动力学模拟技术预测氨基酸残基之间的相互作用,从而设计出更稳定的蛋白质结构。

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及其发酵条件优化

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及其发酵条件优化

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及其发酵条件优化
马莉;刘慧燕;方海田;辛世华;李一鸣;贺捷群
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2022(41)7
【摘要】以浆水作为菌株分离源,分离筛选产γ-氨基丁酸(GABA)乳酸菌,采用薄层层析法和高效液相色谱法定性定量分析GABA,并对筛选菌株进行形态学观察、生理生化试验及分子生物学种属鉴定、发酵特性分析及发酵条件优化。

结果表明,共分离筛选出21株乳酸菌,具有产GABA能力的有6株,经鉴定其中5株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),1株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)。

选取GABA产量最高的一株植物乳杆菌,编号为2,通过单因素试验及响应面试验确定其最适发酵条件为:初始pH值5.8,发酵温度36℃,发酵时间60 h。

在此优化条件下,GABA产量可达0.78 g/L,比优化前产量(0.22 g/L)提高约3.5倍。

【总页数】7页(P94-100)
【作者】马莉;刘慧燕;方海田;辛世华;李一鸣;贺捷群
【作者单位】宁夏大学食品与葡萄酒学院宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室;宁夏工商职业技术学院旅游管理系
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
【相关文献】
1.产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及发酵条件初步优化
2.产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及发酵条件优化
3.乳酸菌SK 005发酵产GABA(γ-氨基丁酸)的条件优化
4.乳酸菌L-SZ303发酵产γ-氨基丁酸条件的优化
5.糟鱼中乳酸菌的分离鉴定及鳓鱼发酵条件优化
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_氨基丁酸液体发酵过程的条件优化及补料研究_黄俊

_氨基丁酸液体发酵过程的条件优化及补料研究_黄俊

2 材料与方法
2.1 试剂 标准 GABA 为 ACROS ORGANICS 公司(Geel,Belgium)产品;丹磺酰氯购自 Fluka Chemie AG 公司
(St. Louis,USA);谷氨酸钠(L-MSG)购自国药集团化学试剂公司;5'-磷酸吡哆醛(PLP)购自上海生工;其 它试剂均为市售分析纯。 2.2 菌种
3.1 GABA 的摇瓶发酵条件 Plackett-Burman 设计对影响 GABA 摇瓶发酵相关因素的效应进行评价并筛选出了有显著正效应的因
素,然后经人工神经网络(ANN)结合粒子群算法(PSO)优化后确定主要影响因素的最佳条件,得到的最佳 培养基组成为(g⋅L−1):葡萄糖 17.6,酵母膏 15,蛋白胨 5,乙酸钠 3,MgSO4·7H2O 0.03,MnSO4·4H2O 0.02,NaCl 0.001,FeSO4·7H2O 0.001,L-MSG 73.3;最佳发酵条件为:初始 pH 6.8,发酵温度 30℃,250 mL 三角瓶中的装液量为 50 mL[11]。在此条件下 Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306 静置培养 72 h,摇瓶 中 GABA 的浓度达到 33.4 g⋅L−1 [11],与目前国内已报道的摇瓶最高产量 5.4 g⋅L−1 相比[10],产量提高 5.18 倍。 3.2 不同通气条件对 GABA 分批发酵的影响
液体种子培养基(g⋅L−1):葡萄糖 10,酵母膏 10,蛋白胨 5,乙酸钠 2,MgSO4·7H2O 0.02,MnSO4·4H2O 0.001,NaCl 0.001,FeSO4·7H2O 0.001,pH 6.8。 2.4 培养方法
从新鲜斜面上将一环菌转接于种子培养基(50 mL/250 mL 锥形瓶),种子培养基在 30℃静置培养 24 h 后,以 10%的接种量接入发酵培养基。瑞士比欧公司(Bioengineering) KLF2000 3.7 L 全自动发酵罐中装 液量为 2 L,搅拌转速为 100 r⋅min−1,通过酸泵和碱泵自动流加 2 mol⋅L−1 H2SO4 或 2 mol⋅L−1 NaOH 溶液 控制培养基的 pH。 2.5 分析方法

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸条件的优化

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸条件的优化

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸条件的优化陈琳;张充;吕凤霞;别小妹;赵海珍;陆兆新【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2015(036)001【摘要】研究重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的适宜条件.检测温度、pH值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响.结果表明:最优转化条件为:转化体系5mL、底物L-谷氨酸钠浓度0.1 mol/L、重组大肠杆菌细胞6.4 mg(干质量)、Triton-100体积分数0.06%、Ca2+浓度0.6 mmol/L,转化温度45℃、反应体系pH 4.5.在该体系下反应7h,GABA合成量达到26.1 g/L,GABA转化效率在1h时达到最高,为13.8g/(g·h),较优化前提高1.5倍.【总页数】6页(P158-163)【作者】陈琳;张充;吕凤霞;别小妹;赵海珍;陆兆新【作者单位】南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q939.9【相关文献】1.响应面法优化重组大肠杆菌生物合成别藻蓝蛋白(holo-apcA)的发酵条件 [J], 周孙林;陈华新;姜鹏;李富超;唐东山2.重组谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的工艺条件优化 [J], 黄燕;宿玲恰;吴敬3.响应面分析法优化重组大肠杆菌生物合成谷胱甘肽的条件 [J], 廖鲜艳;朱至;陈坚;堵国成4.重组大肠杆菌合成左旋多巴条件的优化 [J], 李华钟;孙伟;王树英;陈坚5.重组大肠杆菌产乙酰乳酸合成酶发酵条件优化 [J], 赵婷;黄礼清;金紫阳;袁思棋;刘君因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

MP1104固态发酵啤酒糟生产GABA的初步优化培养

MP1104固态发酵啤酒糟生产GABA的初步优化培养

收稿日期:2007-12-28作者简介:张徐兰(1980-),女,山东烟台人,在读硕士研究生,研究方向:生物转化。

通讯作者:吴天祥。

MP1104固态发酵啤酒糟生产GABA的初步优化培养张徐兰,郑岩,吴天祥,黄小玲,陈岩(贵州大学化工学院,贵州贵阳550003)摘要:从市售腐乳中筛选出红曲霉菌种MP1104,发现其在啤酒糟中有较好的产GABA能力。

初步研究了MP1104在啤酒糟中生产GABA的发酵条件并进行了条件参数优化,得出最佳的发酵条件,为装瓶量35g、发酵温度26℃、发酵周期8.08d,预测的GABA最佳条件下的产量为0.1743mg/g。

关键词:啤酒糟;MP1104;GABA;固态发酵;优化中图分类号:TS262.5;TS261.4;X797文献标识码:B文章编号:1001-9286(2008)05-0105-03OptimizationofSolidFermentationConditionsofMP1104inBeerDregstoProduceGABAZHANGXu-lan,ZHENGYan,WUTian-xiang,HUANGXiao-lingandCHENYan(ChemicalEngineeringDepartmentofGuizhouUniverdity,Guiyang,Guizhou550003,China)Abstract:ItwasfoundthatMonascuspurpureus(MP1104),screenedfromsoycheese(soldinthemarketinGuizhou),couldproduceGABAinbeerdregs.ThefermentationconditionsofMP1104inbeerdregstoproduceGABAwerestudiedandthentherelativetechnicalparameterswereoptimizedasfollows:35gflaskfillingquantity,fermentationtemperatureat26℃,and8.08dfermentationperiod.Undertheaboveconditions,theoutpoutofGABAwouldreach0.1743mg/g.Keywords:beerdregs;MP1104;GABA;solidfermentation;optimizationγ-氨基丁酸(GABA)是一种天然的非蛋白氨基酸,是存在于哺乳动物中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质,具有降血压、镇静安神、治疗癫痫、增强记忆力、调节激素分泌、控制哮喘及活化肝肾功能等生理活性。

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重组GAD清酒酵母合成GABA条件优化与稳定Y-氨基丁酸(GABA)在生物体内天然存在并且分布较广,一般动物植物等有机体内都可以检测到。

研究发现,Y-氨基丁酸在生理方面有很多重要的功能。

在哺乳动物脑和脊髓内发现γ-氨基丁酸的存在,并能够产生多种作用效果:可对组织内心血管的收缩与舒张有一定的改善效果;也可以通过对神经系统的作用特定治疗某些神经型疾病,对于神经性疾病的治疗效果较之其它种类药物,使用GABA治疗效果较好;在调节内分泌系统的分泌过程中有着不可替代的作用;有效的调节并且改善肝功能与肾功能,有保肝利肾功效。

在实际应用中,发现通过在饲料中添加一定量的γ-氨基丁酸能够使得畜禽对于周围环境的刺激作用有一定的耐受性,就是常说的抗应激作用。

在GABA作用下,可以有效的使家禽的生长发育良好,促进机体生长。

基于γ-氨基丁酸以上的特殊作用,人们会对它进行更加深入的研究,并且将会成为今后药物研发,食品开发以及饲料添加剂等方面的热点。

谷氨酸脱羧酶(GAD)能够作用于底物谷氨酸,使谷氨酸被催化发生脱羧反应,得到Y-氨基丁酸。

谷氨酸脱羧酶的实质是一种蛋白质酶,而酶类作为一种催化剂有高效性以及专一性。

所以谷氨酸脱羧酶也具有这些酶的通性。

由于谷氨酸脱羧酶反应效率较高,可以利用菌体的内源性谷氨酸脱羧酶加以研究并利用它进行制备Y-氨基丁酸。

本研究的基础在于找出基因中操控表达谷氨酸脱羧酶的基因片段,并利用分子生物学技术对目标菌种的基因进行构建与重组。

本论文研究的目的是:通过诱导培养或转化培养使得重组酵母菌内谷氨酸脱羧酶的表达水平得以提升。

选择最适宜重组酵母菌发生转化反应的条件,使谷氨酸为底物的脱羧反应更
加易于转化生成γ-氨基丁酸。

为了达到以上的目标,首先克隆操控谷氨酸脱羧酶表达的基因片段,将该片段重组在BG1805简易载体中并加以培养表达。

这个前期工作是与日本友人完成。

本论文所涉及到的内容基本可以概括为以下几个方面:对构建的含有基因GAD 1的重组酵母进行激活培养与诱导培养;在这种重组酵母加以培养过程中添加不同诱导剂,培养后对其翻译表达出的物质进行分离、纯化;使用不同诱导条件的培养给谷氨酸脱羧酶的影响进行分析;通过外部因素控制,如温度调节不同以及一些添加剂外部因素对于该酶表达活力的影响,研究了此产物的酶活性的特点,筛选出可以提高重组酵母产生该酶的量与活性的有利因素。

通过添加不同活性剂或者化学试剂,研究了其对酶活性影响。

探究利用转化法得到GABA过程中,给予不同条件对该种重组酵母菌的活性调节机理,寻找最利于转化法发生的条件。

发酵法与转化法各有利弊,在利用菌体直接转化底物生成γ-氨基丁酸时,通过调节人工可控培养条件,对该反应最适合发生的条件进行控制,使其达到该种重组酵母最大程度转化成为Y-氨基丁酸的效果。

为了使重组酵母菌菌内谷氨酸脱羧酶的富集以及提高γ-氨基丁酸产量的目标得以实现,进行了研究性试验,尝试利用重组酵母菌菌内的谷氨酸脱羧酶经过催化反应合成Y-氨基丁酸的量提高提供了理论与物质基础。

判定的指标可以利用改良版纸层析法测得生成丫-氨基丁酸的量。

在转化的过程中确定γ-氨基丁酸含量与底物谷氨酸的含量,计算摩尔转化率以及负流量。

GAD的诱导、分离、纯化的结果:添加不同浓度的棉籽糖(raffinose)与半乳糖(galactose),进行激活与诱导的培养重组GAD1基因载体菌。

激活培养45h
后, SC-URA 2% raffinose培养液0D值为3.65, SC-URA 2% galactose培养液OD值为0.21。

OD值越大,则证明产生的菌体数量越多,凭借的就是紫外分光光度计的作用
原理。

分析说明了添加raffinose的培养基有利于菌种的激活。

在诱导培养的过程中测得3XYP+ 6% raffinose培养液0D值为16.5,3×YP+6% galactose培养液0D值为8.1,则证明3XYP+6% raffinose液体培养基时诱导培养该重组酵母产生菌种数量较多。

将培养出来的重组酵母菌进行超声波破碎,使含有酶的液体经过低压液相色谱纯化仪进行蛋白的分离与纯化,纯化蛋白质利用凝胶电泳测定分子量,并检测不同诱导条件生成谷氨酸脱羧酶的量。

结果显示,在3×YP+6% raffinose培养基中分离到0.008g/mL,3×YP+6% galactose培养基分离到0.06g/mL,分子量为67kD。

添加raffinose的培养基可以培养的菌种数量虽然较多,但是表达GAD的效果并不理想。

所以选择添加galactose作为诱导剂效果较好。

对酶活性的测定结果:纯化获得的谷氨酸脱羧酶加入到含有底物谷氨酸的培养基中,经过3h后,使用改良纸层析法检测γ-氨基丁酸的产量。

添加galactose诱导产生的GAD使得1.75mg/4mL谷氨酸减少到0.25mg/4mL,而Y-氨基丁酸由0变为1.35mg/4mL。

添加raffinose诱导产生的GAD使
1.75mg/4mL谷氨酸减少到1.5mg/4mL,而γ-氨基丁酸由0变为0.25mg/4mL。

结果说明YP+6% galactose培养条件诱导得到谷氨酸脱羧酶酶活性较好,催化谷氨酸的效率高。

影响酶活性因子的测定结果:通过添加磷酸吡哆醛(PLP)、吡哆醇、吡哆醛三种辅酶因子,对比它们对谷氨酸脱羧酶活性影响,PLP能够促使催化谷氨酸生成GABA,并且效果好。

在温度、pH值、作用时间最优的条件下γ-氨基丁酸产量最佳时消耗PLP的量,为2.4μmol/4ml。

pH值对酶活性的影响,最适值测定结果约为4.8上下。

温度影响酶活性得出最优温度40℃。

与活性剂的作用和化学物质的作用知道异戊醇与Mn2+可使谷氨酸脱羧酶活性增高。

转化法合成GABA的优化结果:通过对转化谷氨酸产生Y-氨基丁酸这个反应所需要的条件进行研究,寻找到重组酵母发生该反应的最佳条件。

使得发生该反应最适合的温度条件应该控制在37℃,pH值约为5.0,选择使用乙酸-乙酸钠缓冲液,添加底物量为0.lmol/L,,添加菌体浓度为6%,摇床培养转速为200r/min,转化的时间约12h,这些有利条件共同作用下,菌体的转化谷氨酸的能力可以达到最理想,并且转化的效果基本稳定。

产生副反应的机会较小,可实现提高GABA的产量。

为大规模生产γ-氨基丁酸提供理论依据。

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