重组GAD清酒酵母合成GABA条件优化与稳定

重组GAD清酒酵母合成GABA条件优化与稳定Y-氨基丁酸(GABA)在生物体内天然存在并且分布较广,一般动物植物等有机体内都可以检测到。研究发现,Y-氨基丁酸在生理方面有很多重要的功能。

在哺乳动物脑和脊髓内发现γ-氨基丁酸的存在,并能够产生多种作用效果：可对组织内心血管的收缩与舒张有一定的改善效果；也可以通过对神经系统的作用特定治疗某些神经型疾病,对于神经性疾病的治疗效果较之其它种类药物,使用GABA治疗效果较好；在调节内分泌系统的分泌过程中有着不可替代的作用；有效的调节并且改善肝功能与肾功能,有保肝利肾功效。在实际应用中,发现通过在饲料中添加一定量的γ-氨基丁酸能够使得畜禽对于周围环境的刺激作用有一定的耐受性,就是常说的抗应激作用。

在GABA作用下,可以有效的使家禽的生长发育良好,促进机体生长。基于γ-氨基丁酸以上的特殊作用,人们会对它进行更加深入的研究,并且将会成为今后药物研发,食品开发以及饲料添加剂等方面的热点。

谷氨酸脱羧酶(GAD)能够作用于底物谷氨酸,使谷氨酸被催化发生脱羧反应,得到Y-氨基丁酸。谷氨酸脱羧酶的实质是一种蛋白质酶,而酶类作为一种催化剂有高效性以及专一性。

所以谷氨酸脱羧酶也具有这些酶的通性。由于谷氨酸脱羧酶反应效率较高,可以利用菌体的内源性谷氨酸脱羧酶加以研究并利用它进行制备Y-氨基丁酸。

本研究的基础在于找出基因中操控表达谷氨酸脱羧酶的基因片段,并利用分子生物学技术对目标菌种的基因进行构建与重组。本论文研究的目的是：通过诱导培养或转化培养使得重组酵母菌内谷氨酸脱羧酶的表达水平得以提升。

选择最适宜重组酵母菌发生转化反应的条件,使谷氨酸为底物的脱羧反应更

加易于转化生成γ-氨基丁酸。为了达到以上的目标,首先克隆操控谷氨酸脱羧酶表达的基因片段,将该片段重组在BG1805简易载体中并加以培养表达。

这个前期工作是与日本友人完成。本论文所涉及到的内容基本可以概括为以下几个方面：对构建的含有基因GAD 1的重组酵母进行激活培养与诱导培养；在这种重组酵母加以培养过程中添加不同诱导剂,培养后对其翻译表达出的物质进行分离、纯化；使用不同诱导条件的培养给谷氨酸脱羧酶的影响进行分析；通过外部因素控制,如温度调节不同以及一些添加剂外部因素对于该酶表达活力的影响,研究了此产物的酶活性的特点,筛选出可以提高重组酵母产生该酶的量与活性的有利因素。

通过添加不同活性剂或者化学试剂,研究了其对酶活性影响。探究利用转化法得到GABA过程中,给予不同条件对该种重组酵母菌的活性调节机理,寻找最利于转化法发生的条件。

发酵法与转化法各有利弊,在利用菌体直接转化底物生成γ-氨基丁酸时,通过调节人工可控培养条件,对该反应最适合发生的条件进行控制,使其达到该种重组酵母最大程度转化成为Y-氨基丁酸的效果。为了使重组酵母菌菌内谷氨酸脱羧酶的富集以及提高γ-氨基丁酸产量的目标得以实现,进行了研究性试验,尝试利用重组酵母菌菌内的谷氨酸脱羧酶经过催化反应合成Y-氨基丁酸的量提高提供了理论与物质基础。

判定的指标可以利用改良版纸层析法测得生成丫-氨基丁酸的量。在转化的过程中确定γ-氨基丁酸含量与底物谷氨酸的含量,计算摩尔转化率以及负流量。

GAD的诱导、分离、纯化的结果：添加不同浓度的棉籽糖(raffinose)与半乳糖(galactose),进行激活与诱导的培养重组GAD1基因载体菌。激活培养45h

后, SC-URA 2% raffinose培养液0D值为3.65, SC-URA 2% galactose培养液OD值为0.21。

OD值越大,则证明产生的菌体数量越多,凭借的就是紫外分光光度计的作用

原理。分析说明了添加raffinose的培养基有利于菌种的激活。

在诱导培养的过程中测得3XYP+ 6% raffinose培养液0D值为16.5,3×YP+6% galactose培养液0D值为8.1,则证明3XYP+6% raffinose液体培养基时诱导培养该重组酵母产生菌种数量较多。将培养出来的重组酵母菌进行超声波破碎,使含有酶的液体经过低压液相色谱纯化仪进行蛋白的分离与纯化,纯化蛋白质利用凝胶电泳测定分子量,并检测不同诱导条件生成谷氨酸脱羧酶的量。

结果显示,在3×YP+6% raffinose培养基中分离到0.008g/mL,3×YP+6% galactose培养基分离到0.06g/mL,分子量为67kD。添加raffinose的培养基可以培养的菌种数量虽然较多,但是表达GAD的效果并不理想。

所以选择添加galactose作为诱导剂效果较好。对酶活性的测定结果：纯化获得的谷氨酸脱羧酶加入到含有底物谷氨酸的培养基中,经过3h后,使用改良纸层析法检测γ-氨基丁酸的产量。

添加galactose诱导产生的GAD使得1.75mg/4mL谷氨酸减少到0.25mg/4mL,而Y-氨基丁酸由0变为1.35mg/4mL。添加raffinose诱导产生的GAD使

1.75mg/4mL谷氨酸减少到1.5mg/4mL,而γ-氨基丁酸由0变为0.25mg/4mL。

结果说明YP+6% galactose培养条件诱导得到谷氨酸脱羧酶酶活性较好,催化谷氨酸的效率高。影响酶活性因子的测定结果：通过添加磷酸吡哆醛(PLP)、吡哆醇、吡哆醛三种辅酶因子,对比它们对谷氨酸脱羧酶活性影响,PLP能够促使催化谷氨酸生成GABA,并且效果好。

在温度、pH值、作用时间最优的条件下γ-氨基丁酸产量最佳时消耗PLP的量,为2.4μmol/4ml。pH值对酶活性的影响,最适值测定结果约为4.8上下。

温度影响酶活性得出最优温度40℃。与活性剂的作用和化学物质的作用知道异戊醇与Mn2+可使谷氨酸脱羧酶活性增高。

转化法合成GABA的优化结果：通过对转化谷氨酸产生Y-氨基丁酸这个反应所需要的条件进行研究,寻找到重组酵母发生该反应的最佳条件。使得发生该反应最适合的温度条件应该控制在37℃,pH值约为5.0,选择使用乙酸-乙酸钠缓冲液,添加底物量为0.lmol/L,,添加菌体浓度为6%,摇床培养转速为200r/min,转化的时间约12h,这些有利条件共同作用下,菌体的转化谷氨酸的能力可以达到最理想,并且转化的效果基本稳定。

产生副反应的机会较小,可实现提高GABA的产量。为大规模生产γ-氨基丁酸提供理论依据。