微生物分类鉴定的方法

微生物分类鉴定的方法

来看看这爷俩儿，像吧，一看就象是父子，基因型决定表型，不会像前面猫爸爸的纠结，但是，下面这个漂亮的男孩会问到，为什么不像就怀疑我们不是父子呢？这些微生物的菌落不像吧，它们看来不是一个家族的，那么怎么让这些微生物认祖归宗，我们在鉴定微生物时到底应该怎么做呢？归纳起来说，微生物的鉴定方法包括根据微生物细胞形态、生理生化特性等经典的分类鉴定方法，还包括根据现代分类鉴定方法，这主要是借助于现代生物学技术，如建立在核酸和蛋白水平进行微生物遗传型鉴定分析，建立在细胞化学成分分析的化学分析方法以及依赖数学统计学或计算生物学水平的数值分类法。

首先来看看经典的分类学方法，这也是最传统的分类学方法。在现代技术建立之前，科学家们主要依赖于传统的方法进行微生物的分类，其基本程序时：首先必须获得拟鉴定微生物的纯培养物，然后需要确定并测定一系列必要的鉴定指标，这些指标的确定就需要根据模式菌株来确定了。最后再根据权威性的菌种鉴定手册，上节课刚刚提到的各类分类学字典，将我们拟鉴定的菌株分门别类进行划分。经典的鉴定方法主要依赖于微生物的形态、生理生化特性、生态学特性、生活史、血清学反应等各种指标。但对不同类群的微生物而言，其所依赖的指标也不尽相同，

如鉴定真菌时，常以其形态特征为主要指标；在鉴定放线菌和酵母菌时，往往形态特征与生理特征兼用；而在鉴定形态特征较缺乏的细菌时，则须使用较多的生理生化和遗传等指标；在鉴定属于非细胞生物类的病毒时，除使用电子显微镜和各种生化、免疫等技术外，还要使用致病性等一些独特的指标和方法。比方说，真菌的形态指标就包括菌丝形态、孢子形态、产孢结构等等，真菌的孢子形态就像植物的种子一样，更是是鉴定的主要依据。鞭毛菌、接合菌、子囊菌和担子菌都有自己独特孢子形态。如鞭毛菌产生无性的游动孢子和有性的卵孢子，接合菌产生无性的孢囊孢子和有性的接合孢子，子囊菌产生无性的分生孢子和有性的子囊孢子，担子菌产生无性的分生孢子和有性的担孢子。而对真菌的产孢结构而言，就像植物的花和果实，是分类的重要指标呀。这些产孢结构如无性阶段的孢囊梗、孢子头、较为复杂的分生孢子器、分生孢子盘、分生孢子座以及有性阶段的子囊壳、子囊盘、子囊腔等等，都是真菌分类的重要指标哟，就像你的长相特征一样，这些真菌的长相就需要这些指标来表示了。但对于原核生物的细菌而言，其细胞结构过于简单，但基本的球状、杆状还是螺旋状还是其鉴定的重要依据了。而对于稍微复杂的放线菌其孢子丝的形态就很重要了。酵母菌的形态更为简单，这就需要其他生理生化特征作为辅助鉴定依据了。当然了，我们前面讲过的细菌的运动性、革兰氏染色结果、菌落形态，液体培养时的形态、典型的生理生化特性、对药物的敏感性试验、致病菌在不同宿主上

的症状特点、噬菌体的敏感性等等，很多很多的指标，所以微生物的传统鉴定方法是很辛苦的差事，能在分类鉴定领域一直做下去的科学家们还是非常了不起的。

一些企业家还是非常聪明的，也是很有商业头脑的，他们看到这种分类鉴定的辛苦，就发明了更为简单快捷的方法，就是微生物的的自动化鉴定技术，商业运作非常好的包括“Biolog”全自动细菌鉴定系统、API细菌数值鉴定系统以及“Enterotube"系统。我们以“Biolog”全自动细菌鉴定系统为例介绍这些系统的工作原理。实际上这些系统就是按照传统的鉴定方法来设计的，因为所有微生物的传统鉴定方法都是需要配置各种培养基或培养液，商家就将这些培养基做成干粉，并提前预置在96孔板中，当需要鉴定某种微生物时，就预先配置好这种微生物的菌悬液，直接将菌悬液接种到预置有各种培养基的小孔里，然后在合适的条件下培养后，放在特定的仪器上分析测定结果，在和标准的微生物菌种库的结果进行比对或根据分类学字典进行分析，就可以很方便的鉴定出该种细菌了。这种系统说的简单点，就是商家省却了你需要配置的各种培养基的麻烦，使各种生理生化试验在一块小小的96孔板上就可以完成。96孔板就是这个样子，很便宜，使用起来也很方便，大大减少了传统分类的工作量了。这样的系统在医院里用的很多哟，尤其是对肠杆菌科的一些致病菌，鉴定起来非常准确，还很方便。

API细菌数值鉴定系统和“Enterotube"系统的工作原理是一样的，只是不是采用96孔板，而是一些长形卡片或分割的小室而已。

微生物分类鉴定的现代方法中的通过核酸分析鉴定微生物遗传型，最常用的就是16S或18S rRNA以及ITS核苷酸序列分析，有时候还需要测定核酸中(G+C)mol％。如果进行新种鉴定的话，鉴定菌株和模式菌株间的核酸分子杂交是必须的，当然，如果你很有钱的化，进行微生物全基因组序列分析就更好了。

16S rRNA核苷酸序列分析是原核生物最常用的，而18S和ITS序列分析则是真核微生物最常用的。之所以选择这些核酸序列进行物种的鉴定指标，是因为这些基因在生物进化和系统分类研究中具有如下的优点。基于16S或18S rRNA 序列的微生物鉴定技术的基本程序是这样的。首先获得拟鉴定微生物的基因组总DNA ，采用PCR技术获得16S rDNA 基因扩增产物，并进行该基因片段的序列分析（这部分工作多委托专业的生物公司进行），然后将该基因片段序列分析结果通过世界上通用的NCBI 文库进行比对，并采用相应的软件就可以构建出该菌株和其相似的已经报道的菌株的系统发育树，看，就是这样的系统发育树，在这个系统发育树中，棕色的M77T菌株就是我们拟鉴定的菌株，和其亲缘关系最近的菌株就是和其处于同一分支的R97T菌

株了，我们在根据R97T菌株的一些典型的生理生化特性，补充这些特性分析，就可以将菌株M77T进行准确的鉴定了。

而(G+C)mol％的测定则需要了解解链温度（又称熔解温度或热变性温度，简写Tm）的概念及原理：在DNA双链的碱基对组成中，AT间结合较弱，而GC间因为有三个氢键，所以结合较牢。天然的双链DNA在一定的离子强度和pH下逐步加热变性时，天然的互补双螺旋就逐步变为单链状态，从而导致核苷酸中碱基的陆续暴露，于是在260nm处紫外吸收值就明显增高，从而出现了增色反应。一旦双链完全变成单链，紫外吸收就停止增加。这种由增色效应而反映出来的打开氢键的DNA热变性过程在一个狭窄的温度范围内完成的。在此过程中，紫外吸收增高的中点值所对应的温度，即为Tm值。由于打开GC对间3个氢键所需温度较高，故根据某DNA样品的Tm就可计算出G-C对的绝对含量。这个图就很好的表示出什么是解链温度。解链温度的测定同样需要提取纯度较高的菌株总DNA，还需要特殊的具电磁加热功能的比色架和感温探头的紫外分光光度计，测定260nm吸光值，然后按照这个公式计算出该菌株的(G+C)mol％。一般而言，当被鉴定菌株与模式菌株间的(G+C)mol％值相差在2.5％-4.0％间，则属于同种不同菌株；相差在5％以上则是同属不同种；差距超过10％，则就不是一个属了。