实验五、水中亚硝酸盐的测定

实验六、 水中氨氮的测定
主要仪器
分光光度计及配套比色皿、25mL具塞比色管、容量瓶、移液管等
试剂
• 以下试剂均使用分析纯试剂及无氨纯水配制。
• 1. 无氨纯水：可按下列方法之一制备，操作必须在无氨污染的清 洁房间内进行：
• （1）离子交换法：纯水通过强酸型阳离子交换树脂（氢型）柱， 将流出水收集在配有密封磨口塞的玻璃瓶中。每升流出水中加入 10g同样的树脂以利于保存。
分光光度分析法：
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。包括比色法、可见分光光度法、 紫外分光光度法、红外光谱法等。
1、基本原理：朗伯-比尔吸收定律 当一束平行单色光照射到有色溶液上时，光的一部分将被溶液吸收，一部分 透过溶液，还有一部分被器皿的表面反射。在实际测量时，通常将试液和空白溶 液分别置于同样质料及厚度的吸收池中，因而反射光强度基本不变（其余条件一 致），其影响可以不予考虑。 设入射光的强度为Io，透过光强度为It，溶液浓度为c，液层厚度为b，则：
实验六、 水中氨氮的测定
目的要求
• 1．掌握纳氏比色法或靛酚蓝法测定水中氨氮的原理和 操作方法。
• 2. 利用所学的基础知识以及基本操作和实验方法，学习 实验设计的基本方法。
• **3. 了解氨氮测定的水样预处理方法及蒸馏分离装置的 安装和使用方法，目的是适应养殖废水的测定。
实验六、 水中氨氮的测定
试剂
1. 磺胺溶液（10g/L）：称取5g磺胺，溶于360mL盐酸溶液（1+6）中，用纯 水稀释至500mL，贮于棕色试剂瓶中，有效期为2个月。
2. 萘乙二胺溶液（1g/L）：称取0.5g盐酸萘乙二胺，溶于适量水后定容至 500mL，贮于棕色试剂瓶中置冰箱内保存，有效期为1个月。
3. 亚于硝11酸0℃盐烘氮干贮）备，溶溶液于（少10量0.纯0µ水g/中ml后）全：部称转取移0.2入456030gm亚L硝容酸量钠瓶（中N，aN加O纯2，水 至标线，混匀。
概述
• 氨 游氮离亦氨称NH总3和氨铵氮盐，N常H用4+N的H形3-式N表存示在。于氨水氮中主，要两以者 的组成比取决于水的pH和水温。正常情况下， 海水中氨氮的含量一般在0.5～50μg/L，但在深 层缺氧的水中，可高达1.5mg/L。淡水中的变化 幅度则较大。一般认为，氨氮对水生生物具有毒 害作用，但真正构成危害的主要是非离子氨 （NH3）。过高含量的NH3会损害水生生物的重 要器官，抑制其生长发育，甚至造成死亡。因此， 在水产养殖过程中，及时监测水中氨氮的含量十 分必要。
度，得到校正吸光度Ai’ （同时要考虑校正Ac），以校正吸光度Ai’为纵坐 标，绘制吸光度对亚硝酸盐氮质量浓度的标准曲线。
管号 1 ml 0 mg/L 0
2
3
4
5
6
7
0.10 0.30 0.50 1.00 1.50 水样1
0.0040 0.0120 0.0200 0.0400 0.0600
8 水样2
实验六、 水中氨氮的测定
方法选择
• 氨氮的测定通常有纳氏试剂法、靛酚蓝法（苯酚-次氯酸盐）、 气相分子吸收法、次溴酸氧化法和电极法等。纳氏试剂法具有操 作简便、灵敏度高等特点，目前在养殖生产中被广泛应用。水中 钙、镁、铁等金属离子、硫化物、醛、酮类、以及水中色度和混 浊等会干扰本法的测定，需要作相应的预处理。在测定海水时直 接显色易发生混浊，需要调整水样或试剂用量。海水氨氮监测的 国家标准法，推荐的是靛酚蓝法和次溴酸氧化法。次溴酸氧化法 灵敏度很高、反应快速、简便，但是只适用于清洁海水。对于水 产养殖水体，常常因为受到还原性物质的干扰而使测定数据不稳 定、误差较大。靛酚蓝法灵敏度略低、反应时间较长，但结果比 较稳定。电极法通常不需要对水样进行预处理，且测量浓度范围 宽，但是含量低时误差大，且需要购置专用的选择性电极和离子 计。气相分子吸收法比较简单，使用专用仪器或原子吸收仪都可 达到良好的效果。氨氮含量高时，可采用蒸馏滴定法，但一般养 殖水体达不到这一高水平。
A=kbc A：吸光度，k为比例常数 其中k的值随b、c的单位而变。当c为g/l时，k用a表示，称为吸收系数
当c为mol/l时，k用ε表示，称为摩尔吸光系数 ε反映吸光物质对光吸收能力，也反映用分光光度法测定该吸光物质的灵敏度， ε越大，方法的灵敏度愈高。 在多组分系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等 于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。A总=A1+A2+A3+……+An
吸光度与透光度的关系： It/ Io=T
2、分光光度计基本部件：
光源、单光器、吸收池（比色皿）、检测器、显示器
3、吸光度测量条件的选择 A、波长选择：以最大吸收波长为测量的入射波长——称为最大吸收原则。 B、吸光度范围的选择：A为0.2-0.8，T为65-15%；当A=0.434（T=36.8%）时测量
• 养殖水体中的亚硝酸盐氮对水生动物具有较强的毒性， 作用机理主要是通过鱼类等的呼吸作用，亚硝酸盐由 鳃丝进入血液，使正常的血红蛋白发生氧化，输氧功 能受到影响，出现组织缺氧从而导致鱼虾缺氧，甚至 窒息死亡。亚硝酸盐还可与仲胺类反应生成致癌性的 亚硝胺类物质。
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方法选择
水中亚硝酸盐氮的测定方法通常采用重氮—偶联 反应，使生成红紫色染料。所用重氮和偶联试剂种类 较多，最常用的一般有对氨基苯磺酸和α—奈胺，该 法简便，灵敏度高，但盐度对吸光度有影响，而且试 剂α—奈胺对人体有致癌作用，现今基本不再使用。 磺胺（对氨基苯磺酰胺）和N-（1-萘基）-乙二胺盐 酸盐（简称萘乙二胺）法灵敏度更高，反应速度快， 试剂较为稳定，而且不受盐度等组分的影响，因此， 该法是目前国内普遍采用的测定亚硝酸盐氮的方法。 当将试剂配制成固体粉末时，适合于野外快速测定。 此外，还有目前国内外普遍使用的离子色谱法和新开 发的气相分子吸收法。这两种方法虽然须使用专用仪 器，但方法简便、快速，干扰较少。
的相对误差最小。 C、参比溶液的选择：进行测量时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于
吸收池壁、溶剂、试剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。 参比溶液可根据下列情况来选择。 （1）纯溶剂空白：当试液、试剂及显色剂均无色时，可直接用纯溶剂（或蒸馏水） 作参比溶液。 （2）试液空白：显色剂为无色，而被测试液中存在其他有色离子，可用不加显色剂 的被测试液作参比溶液。 （3）试剂空白：试液无色，而试剂或显色剂有颜色时，可选择不加试样溶液的试剂 空白作参比溶液。 （4）显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来， 使之不再与显色剂作用，而显色剂及其它试剂均按试液测定方法加入，以此作为 参比溶液，这样就可消除显色剂和一些共存组分的干扰。 （5）改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液 消除干扰。 4、标准曲线的制作 5、示差法测量高含量组分
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磺胺和萘乙二胺试剂法 原理
在酸性介质中亚硝酸盐与磺胺进行重氮化反应，其产物再与盐酸萘乙二 胺偶合生成红色偶氮染料，在543nm波长处测定吸光度。本方法最低检出 浓度(以N计)为0.02µmol/L，测定上限为10μmol/L。
主要仪器
分光光度计及配套比色皿、25mL具塞比色管等。
Байду номын сангаас
浓度（mg/L），纵坐标为系列标准溶液的校正吸光度
Ai’，所得标准曲线应为通过原点的直线，同时可求得直
线回归方程：
A'
b { } ' NO-2 -N mg/L
2. 计算含量： 水样中亚硝酸氮含量可按下式计算：
{ } NO-2 -N mg/L
A'水样 b'
25.0 {V水样}mL
或在标准曲线图中查出亚硝酸氮含量。
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操作步骤——水样测定
• • （ 曲1线）制取作适过量程水的样步（骤V（水样2） ）～于（比4色）管，中显，色用并纯测水定定该容水到样2的5m吸L，光参度照A水标样准。 • （2）同时取25mL纯水，代替水样重复上述操作，获得试剂空白的吸光
度 光（度同（标同准时曲要线考中虑的校1正号A比c）色，管得）到。样将品样的品校吸正光吸度光A度水样A扣‘水除样。试剂空白的吸
水样于比色管中，用纯水定容到25mL，加入0.5mL磺胺溶液和0.5mL纯 水 的，样混品匀读。数放中置减显去A色t值15。min后，测定吸光度At。在计算结果时，应从对应
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结果与计算
1. 绘制标准曲线和求算回归方程：采用相应软件（如
Excel）处理标准曲线数据并绘图，横坐标为亚硝酸氮
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纳氏试剂法——原理 纳氏试剂是碘化汞钾的强碱性溶液，它能与氨氮反 应生成棕色的难溶络合物，浓度很小时，在水中以胶态 形式存在，呈现为橙黄色。反应如下式所示：
以胶体状态分散在水中的络合物，在波长420nm处， 浓度低于150μmol/L(以N计)范围内，其吸光度与氨氮含 量成正比。水样中的Ca2+、Mg2+和铁离子能与试剂中的 强碱作用产生沉淀，对测定有干扰，预加酒石酸钾钠可 以避免沉淀的生成。本法的最低检出浓度为0.025mg /L， 测定上限为2mg/L。
4. 亚硝酸盐氮使用溶液（1.000µg/ml） ：取1.00mL贮备液于100mL容量瓶 中，用纯水稀释至标线，混匀。临用前配制。
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操作步骤——水样预处理 • 若水样浑浊，可通过以下方法预先处理。 • ①可取一定体积的水样，恒温离心（4000或
5000r/min，20min），取上清液备用。 • ②经0.45μm滤膜抽滤（采用针头过滤器安装
*操作步骤——比色皿校正（Ac）
• 将4个比色皿注入纯水，以其中1个为参比溶液，测定其他3个比色皿的吸 光度Ac。若Ac不等于0，在计算结果时，应从对应的样品读数中减去Ac 值。
*操作步骤——浑浊吸光值的测定
• 若水样不经预处理，直接进行比色测定，为了得到准确的测定结果，需
要进行浑浊吸光度的测定。其方法是：取适量（与测定水样时保持一致）
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目的要求
• 1. 掌握亚硝酸盐氮的测 定原理和方法。
• 2. 熟悉分光光度计的使 用方法。
• 3. 理顺氨氮的氧化与硝 酸氮的还原的过程，为 测定氨氮和硝酸盐氮奠 定基础。
• 4．了解亚硝酸盐氮的 快速测定方法。
实验五、水中亚硝酸盐的测定
概述
• 亚硝酸盐氮是无机氮化合物之一，是氨氮被氧化和硝 酸氮被还原的中间产物，不稳定。通常以其亚硝酸根 中的氮原子来计量，用符号N02-N表示。洁净地面水 中亚硝酸盐氮的含量一般不超过0.01mg/L；海水中 亚硝酸盐氮含量的变化幅度为0.1～30µg/L。
0.45μm滤膜挤压过滤的方法，操作比较方便） 后得到澄清水样备用。
实验五、水中亚硝酸氮的测定
操作步骤——制作标准曲线
（1）取8支25mL具塞比色管，分别加入下表所示体积的亚硝酸盐氮标准使 用溶液，加纯水至标线，混匀。水样直接取样至标线（25ml）。
（2）每支比色管中分别加入0.5mL磺胺溶液，混匀，放置1min。 （3）分别加入0.5mL萘乙二胺溶液，混匀，放置显色15min。 （4）在波长543nm波长处，用1cm比色皿，以纯水作参比，测定吸光度Ai。 （5）以上述系列标准溶液测得的吸光度Ai扣除试剂空白（1号管）的吸光
2．标准色阶的制备：取刻度和高度都相同的10mL比色管，参照 上述标准曲线的做法，分别加入一系列的亚硝酸盐氮标准使用 液，用纯水稀释至刻度，分别加入固体试剂约40mg，摇匀，放 置10min后，将所呈颜色印制下来，则得标准色阶。
3．水样测定：取水样10ml与同样的比色管中，加固体试剂约 40mg，摇匀放置10min，与标准色阶比色。取与标准色阶相似 的浓度即可求得水中亚硝酸盐氮的含量。
实验五、水中亚硝酸氮的测定
亚硝酸盐氮的快速测定法——固体试剂法
以重氮化偶合比色法为基础，采用固体试剂和试纸法，可以 快速测定水体中亚硝酸盐氮的含量。固体试剂法的灵敏度和准 确度都较高，且试剂可长期贮存使用。试纸法操作更为简便， 但灵敏度和准确度较差。两种方法都可为野外的工作带来极大 的方便。
1．固体试剂：将对氨基苯磺酸∶盐酸α—奈胺∶酒石酸（105℃烘 干2h）按10∶1∶89的比例，充分磨细混合，装瓶盖严，可久藏 不变。