实验报告脂类的化学——苏丹三染色

一．实验目的

1.熟悉脂类的显示技术。

2.了解脂类在细胞中的分布。

二．实验原理

脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。

脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。

脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。

用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。

用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：冰冻切片，明胶包埋冰冻切片，铺片法。

本实验中使用的脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。

苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪。当它与含有脂类的标本接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂结构中使其显色。

三．实验仪器及试剂

1.仪器

解剖盘，解剖剪，镊子，盖玻片，载玻片，显微镜，胶头滴管

2.试剂

苏丹Ш染液，甲醛钙溶液，70%乙醇溶液，蒸馏水

3.材料

小白鼠一只

四．实验步骤

1.断头法处死小鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，

并在其下放置一载玻片，用剪将连同载玻片和其上粘着的肠系膜取下。滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定分钟。

2.将蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管吸取液体以冲净固定液。

3.用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。

4.用苏丹Ш染色30分钟。

5.吸干溢出的染液，擦净盖玻片表面及周边，显微镜观察。

五．实验结果

图1 小鼠肠系膜毛细血管及周围脂肪细胞

图2 小鼠单个脂肪细胞，细胞核呈“指环状”

六．讨论与结论

1.实验中出现的问题

在这次实验中，我们的小鼠肠系膜标本染色不深，很多地方甚至出现了没有染上的现象。虽然最终还是观察到了单个脂肪细胞的形状，但是由于染色太浅，观察到的结果不是十分理想。经过思考，我认为可能是我们在染色的时候没有及时向拨片上补充染液，中间只添加了一次染液，导致染色效果不好。也有可能是选取小鼠的肠系膜毛细血管处过厚，多层细胞堆积在一起。

2.注意事项

1)染色后，要用吸水纸吸去染液后再观察，这样只有脂肪细胞被染色，便于观察。

2)在制片时动作一定要轻，以免将小鼠的肠系膜破坏。

3)观察时要选取有毛细血管的肠系膜部分，因为血管周围一般有脂肪组织保护。

4)染色过程中要不断滴加苏丹三染液，防止装片干燥，影响实验结果。

5)不要用力按压盖玻片，以免压破脂肪细胞，影响观察。

七．拓展知识

1.石蜡切片制备：

石蜡切片的制作过程主要包括：取材、固定、脱水、透明、透蜡、封藏、透明、染色、贴片、切片、包埋。

2.糖类细胞化学

PAS法显示糖类

原理：过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合成红色，定位于胞浆上。

结果：PAS阳性为红色，细胞核蓝色。

3.核酸细胞化学

Feulgen反应法

原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

甲基绿-派洛宁法

原理：甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA 选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。

其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。

即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。

Giemsa染色法

原理：Giemsa染液由天青，伊红组成，染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。

嗜酸性颗粒碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果染成粉红色，称为嗜酸性物质；

细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合染成紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

结果：MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。

苏木精-伊红（HE)染色

原理：DNA两条链上的磷酸基向外，带负电荷呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。

结果：细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。

4.蛋白质细胞化学

碱性蛋白与酸性蛋白显示

以酸性氨基酸成分为主的蛋白质为酸性蛋白；以碱性氨基酸为主的蛋白质为碱性蛋白。细胞核内有组蛋白（碱性蛋白）及少量酸性蛋白，细胞质中主要有酸性蛋白，标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用不同PH值的快绿染液分别染色，使细胞内的酸