革兰氏阴性细菌抗生素耐药检测

对该株阴沟肠杆菌应考虑联合治疗（如-内酰胺类+氨基糖苷类或氟喹诺酮类）
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
标本：气管吸取物 诊断：肺炎
阴沟肠杆菌
氨苄西林 头孢唑林 头孢噻肟 头孢西丁 头孢吡肟 环丙沙星 庆大霉素 亚胺培南
哌拉西林-三唑巴坦
复方磺胺
MIC (µg/ml)
>32 R >32 R >32 R >32 R
哌拉西林-三唑巴坦
复方磺胺
>32 R >32 R
8S 1S 8S >4 R 4S 1S 8 S >4/76 R
初步报告 例:
*隐藏头孢吡肟和头孢噻 肟的“敏感”结果
“这株肺炎克雷伯菌可疑产超广谱beta內酰胺酶；确证试验还未完成”
ESBL阳性的确证试验
头孢他啶/克拉维酸 头孢他啶
头孢噻肟/克拉维酸
物，包括碳青霉烯 类
乙酸
头孢菌素
染色体和质粒 染色体和质粒
金属酶(如 VIM, IMP)
AmpC, 头孢菌素酶, CMY
D (丝氨酸)
苯唑西林， 氯唑西林
± 克拉维酸
质粒
苯唑西林酶
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Bush. 1995. AAC 39:1211-1233
染色体介导的AmpC -内酰胺酶
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标本：气管吸取物 诊断：肺炎
阴沟肠杆菌
氨苄西林 头孢唑啉 头孢噻肟 头孢西丁 头孢吡肟 环丙沙星 庆大霉素 亚胺培南
哌拉西林-三唑巴坦
复方磺胺
终报告
MIC (µg/ml)
>32 R >32 R
4S >32 R
4S 0.5 S 0.5 S 0.25 S ≤8 S 0.5/9.5 S
732个病人中有11个在治疗中发展为第三 代头孢菌素耐药
– 10株肠杆菌属菌
– 1株劳地枸橼酸杆菌
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Choi et al. 2008. Antimicrob Agents Chemother. 52:995.
质粒介导的-内酰胺酶
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原始的质粒介导-内酰胺酶
ESBL
ESBL KPCs、其它
在欧洲出现 在美国出现
2009 300种以上-内酰胺酶被报导
-内酰胺酶家族
分子分型
优势底物
抑制剂
定位
举例
A ( 丝氨酸)
青霉素 头孢菌素
克拉维酸
质粒（K1在染色体上 青霉素酶, ESBLs,
）
KPCs, SME
B (锌离子)
C (丝氨酸)
所有β-内酰胺类药 乙二胺四
– 通过TEM-1, TEM-2, SHV-1的突变产生 – ESBLs有很多种不同敏感谱的酶型(TEM 150 种;
SHV 100 种; CTX-M 50 种)
不水解头霉素类
可被内酰胺酶抑制剂抑制（如克拉维酸）
Website listing -lactamases: http://www.lahey.org/Studies
当SPICE菌群对第三代头孢菌素敏感时应如 何报告？
报告第三代头孢菌素敏感?
将所有头孢菌素结果由敏感改为耐药，除外头孢吡肟
隐藏第三代头孢菌素的结果
添加注释如“由于高的耐药突变选择性，尽管体外结果 敏感，第三代头孢菌素可能对阴沟肠杆菌无效”
添加注释，提示当菌株对第三代头孢菌素耐药时，可 以与另一种有效的药物进行联合治疗。
CTX 30
继续培养-第三天；选择抑菌圈中的菌落重新测试
源自文库
头孢噻肟
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阴沟肠杆菌2号 抑菌圈中菌落
不同药物的诱导/选择能力
好
差
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诱导AmpC -内酰胺酶 头霉素 碳青霉烯类药物 克拉维酸 头孢噻吩 氨曲南 第三代头孢菌素
选择AmpC耐药突变 第三代头孢菌素 氨曲南 头孢噻吩 碳青霉烯类药物 头霉素
对ESBLs我们应知道什么?(2)
携带ESBL基因的质粒会同时携带多个耐药 基因
– 氨基糖苷类，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，氟喹诺酮 类，氯霉素，四环素
产ESBL菌株导致的血流感染通常与高的死 亡率相关
在医院和护理室的暴发流行-对感染控制很重 要
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标本：腹水 诊断：腹膜炎
*也包括蜂房哈夫尼菌，气单胞菌属，鲍曼不动杆菌和某些非发酵 格兰阴性杆菌
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ß-內酰胺酶诱导
阴沟肠杆菌
常规不必做此试 验
一旦移除诱导剂，菌株 重新对头孢噻肟“敏感”
头孢噻肟 （第三代头孢菌素）
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头孢西丁 （诱导剂）
什么是“稳定去阻遏”耐药突变的选择（1）？
染色体AmpC基因自发突变 与药物暴露无关 可在体外和体内发生；不可逆…将其称为“稳定的
去阻遏突变”
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什么是“稳定去阻遏”耐药突变的选择（2）？
突变： – 发生频率为10-6 至 10-8
– 结构性地（持续地）产生大量AmpCß-內酰胺酶 – 对第三代头孢菌素，氨曲南，碳基（如替卡西林）和脲基青霉素
革兰氏阴性细菌抗生素 耐药检测
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2020年4月9日星期四
在这次讲座后，你可以……
列举AMPC -内酰胺酶导致耐药的检测和报告 描述大肠杆菌、克雷伯菌、奇异变形杆菌和其
它肠杆菌科菌的ESBL检测 描述碳青霉烯酶表型检测方法 讨论目前关于非肠杆菌科菌的药敏注释
肠杆菌科菌对-内酰类药物的耐药机制
肺炎克雷伯菌
氨苄西林 头孢唑林 头孢噻肟 头孢西丁 头孢吡肟 环丙沙星 庆大霉素 亚胺培南
哌拉西林-三唑巴坦
复方磺胺
MIC (µg/ml)
>32 R >32 R
8S 1S 8S >4 R 4S 1S 8 S >4/76 R
我们怎么办？
对这份报告我们需了解什么？
结果提示菌株可能产ESBL 头孢菌素的结果可能有误导性（如体外敏感
灭活青霉素和窄谱头孢菌素 TEM-1
– 在大肠杆菌中导致氨苄西林耐药
– 在流感嗜血杆菌中导致氨苄西林耐药 – 在淋球菌中导致氨苄西林耐药
TEM-2与TEM-1相似 SHV-1
– 在肺炎克雷伯菌中导致氨苄西林和头孢噻吩耐药
被内酰胺酶抑制剂抑制（如克拉维酸） 不水解超广谱ß-內酰胺类药物（如第三代和第四代头孢
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类别：头孢类
(部分列表)
第一代
头孢唑啉 头孢噻吩 头孢氨苄
亚类：头孢菌素
窄谱
第二代
头孢孟多 头孢尼西 头孢呋辛
第三代
头孢哌酮 头孢噻肟 头孢他啶 头孢唑肟 头孢曲松
广谱
第四代a 头孢吡肟
亚类：头霉素
头孢美唑 头孢替坦 头孢西丁
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a 不被AmpC水解
但药物在体内无效） 假如报告头孢噻肟（或头孢吡肟）”敏感“，
临床医生使用了其中一种药物，病人可能治 疗失败甚至死亡！
ESBL检测/报告 目前的CLSI建议
菌株：
– 检测大肠杆菌，克雷伯菌属，奇异变形杆菌
筛选试验：
– 观察菌株对超广谱ß-内酰胺类”筛选“药物”有否敏感性降 低
表型确证试验：
– ß-内酰胺酶抑制剂恢复了头孢噻肟，头孢他啶或两者的 活性
菌素）
质粒介导-内酰胺酶的进化
大肠杆菌
肺炎克雷伯菌
TEM-1, TEM-2, SHV-1在菌株突变中
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菌株获得AmpC基因
质粒介导-内酰胺酶 超广谱-内酰胺酶（ESBLs）
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对ESBLs我们应知道什么?(1)
灭活（水解）超广谱-内酰胺药物
建议： 治疗3-4天后检测相似感染部位分离出的同种细 菌的敏感性以查看菌株是否仍对第三代头孢菌素 敏感。
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CLSI M100-S19. Table 2A.
最初培养-第一天
头孢噻肟
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阴沟肠杆菌1号
继续培养-第三天
头孢噻肟
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R
R
R
R R
R
R
R
R
R
R R
我们需要做特殊试验来检测ß-內酰胺类 耐药突变吗？
不 假如培养中存在很多的耐药（突变）菌株
，该细菌会被检测为耐药。 对于以往敏感的病原菌，需按照CLSI原则“
重新”测试以确定病人体内是否出现耐药菌 株。
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CLSI重测原则
原先敏感的菌株可能在治疗后会变为“中介”或“耐药”。这可能发生 在肠杆菌属，枸橼酸杆菌属和沙雷菌属用第三代头孢菌素治疗3天 内。
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我们需增加对-内酰胺药物报告的注释吗？
我们须知道那些关于AmpC -内酰胺酶和肠 杆菌科菌的知识？
AmpC -内酰胺酶水解除了碳青霉烯类药物 和头孢吡肟外的其他-内酰胺药物
– 不被-内酰胺酶抑制剂抑制 – 临床关注点是对测试“敏感的”三代头孢菌素
的水解作用
对于AmpC基因在染色体上的菌种有两种 类型。
一些检测系统在原始药敏板上即配备了确证试验；不
必要进行两步检测
CLSI M100-S19. Appendix A.
CLSI M100-S19. 附录A
ESBL筛选试验
假如结果符合以下标准，则大肠杆菌，克雷伯菌或奇异变形杆菌为“可 疑”产ESBL菌株…
抑菌圈 (mm)
*头孢泊肟**
17
*头孢他啶
22
*头孢噻肟
27
头孢曲松
25
氨曲南
27
* 只有这些药物适于奇异变形杆菌
**对奇异变形杆菌为22 mm 和>1 g/ml
MIC (µg/ml) >4 >1 >1 >1 >1
CLSI M100-S19. Appendix A.
标本：腹水
诊断：腹膜炎
肺炎克雷伯菌
MIC (µg/ml)
氨苄西林 头孢唑林 头孢噻肟 头孢西丁 头孢吡肟 环丙沙星 庆大霉素 亚胺培南
复方磺胺
MIC (µg/ml)
>32 R >32 R 8S R 1S 8S R >4 R 4S 1S 8 S >4/76 R
终报告
“该菌株的确证试验提示为少见的耐药类型【产超广谱beta內酰胺酶（ESBL）】”
– 很少有可能病人同时接受诱导剂和第三代头孢菌素治 疗，所以通常不是一个临床难题！
某些特定菌属的特点 诱导是可逆的
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最常产生AmpC -内酰胺酶的菌株-“SPICE”菌群*
粘质沙雷菌 铜绿假单胞菌
吲哚阳性变形菌群-摩根摩根菌&普罗威登菌
弗劳地枸橼酸杆菌
肠杆菌属
头孢噻肟
26 mm
10 mm
阳性的ESBL表型确证试验=头孢噻肟或头孢他啶加克拉维酸后其抑菌 圈直径比头孢噻肟或头孢他啶单药大5mm或以上（仅需要其中一对阳 性即可）
标本：腹水 诊断：腹膜炎
肺炎克雷伯菌
氨苄西林 头孢唑林 头孢噻肟 头孢西丁 头孢吡肟 环丙沙星 庆大霉素 亚胺培南
哌拉西林-三唑巴坦
- AmpC的诱导 - “耐药”突变的选择
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标本：气管吸取物 诊断：肺炎
阴沟肠杆菌
氨苄西林 头孢唑啉 头孢噻肟 头孢西丁 头孢吡肟 环丙沙星 庆大霉素 亚胺培南
哌拉西林-三唑巴坦
复方磺胺
MIC (µg/ml)
>32 R
>32 R 4S
>32 R 4S
0.5 S 0.5 S 0.25 S ≤8 S 0.5/9.5 S
通透性降低和/或药物在细胞中的累积减 少
– 通透蛋白改变 – 外排泵
靶位青霉素结合蛋白的修饰 -内酰胺酶
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革兰阴性菌中-内酰胺酶的进化
氨苄西林 1965
超广谱头孢菌素
1970s
1983 1988 2000
1963
TEM-1
TEM-1
大肠杆菌
在28Gm(-)
副伤寒沙门菌 菌中报道
染色体AmpC -内酰胺酶
AmpC -内酰胺酶诱导产生
产AmpC -内酰胺酶突变株的 选择
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两种类型可导致对第三代头孢菌素的耐药
什么是AmpC -内酰胺酶的诱导？
-内酰胺类诱导剂（如头孢西丁或碳青霉烯 类药物）激发AmpC -内酰胺酶的产生
– 细菌有AmpC基因（染色体上）但不消耗能量来产生 大量的AmpC -内酰胺酶，除非菌株有被-内酰胺药 物杀灭的危险（AmpC基因被抑制）
4S 0.5 S 0.5 S 0.25 S 128 R 0.5/9.5 S
药敏谱提示为AmpC稳 定去阻遏突变株
第三代头孢菌素变为耐药 头孢吡肟保持敏感
不被内酰胺酶抑制剂抑制
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SPICE菌群对第三代头孢菌素的耐药出现….AmpC 内酰胺酶
732个肠杆菌属，弗劳地枸橼酸杆菌，粘 质沙雷菌，摩根摩根菌感染的病人
（如哌拉西林）耐药 – 不同菌种耐药突变的选择频率不同
- 肠杆菌属-高 - 沙雷菌属-低
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治疗前菌群
治疗后菌群
S S
S
S
R
S
使用第三代头孢菌素 （如头孢噻肟）
S
S
S
S
S S
• 在“敏感”菌群中耐药突变株已预先存在
• 第三代头孢菌素杀灭了敏感菌
• “耐药”菌株繁殖
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