第二章-碳代谢与代谢工程
代谢工程复习
一、根据生化代谢系统反应反应特点对生物体生化反应进行分类：1. 装配反应（Assembly Reaction）：完成大分子的修饰，并将大分子运输到细胞内的特定区域，最终使其参与细胞结构元件的合成，如细胞壁、细胞膜等2. 聚合反应（Polymerization Reaction）：使细胞构建单体聚合形成生物大分子，聚合过程均为长链式，中间伴有分支反应。
3. 生物合成反应（Biosynthesis Reaction）：最终产物是参与聚合反应的构建单体以及一些辅酶等。
以级联形式组合，形成特定的生物合成途径，合成途径中编码不同酶的基因成簇分布，通常是一个操纵子。
4. 产能反应（Fueling Reaction）：分解代谢途径中的12种生物合成前体，产生能量合成ATP。
ATP提供能量，产生还原力（NADPH）。
二、术语1. 底物：培养基中的化合物，能被细胞进一步代谢或直接构成细胞组分。
碳源、氮源、能源、无机盐2. 代谢产物：细胞产生并分泌到细胞外的化合物，分为初级代谢产物（CO2、乙醇等）、次级代谢产物（该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等）、蛋白质3. 生物基质要素：生物大分子，RNA、DNA、蛋白质、脂质、糖类4. 胞内代谢物：代谢途径的中间产物以及用于合成大分子的结构单元5. 途径：代谢物的转化、信息传递以及其他反应的过程6. 生化反应途径、代谢途径：由一系列连续的生化反应构成。
在活细胞中则称为代谢途径7. 生物反应网络：生化途径汇总构成网络8. 代谢网络：包括物质代谢网络、能量代谢网络，由分解、合成、膜运输途径构成9. 代谢网络的联网：通过化学反应或生化反应将化合物与代谢网络连接10. 通量/物流：物质、信息通过代谢途径产生的速率11. 代谢流（碳架物质流）：代谢物在代谢途径中形成代谢流，某一代谢途径的代谢流（Flux）定义为流入代谢物被途径加工成流出代谢物的速率。
代谢工程复习纲要
代谢工程（Metabolic engineering）是生物工程的一个新的分支。
代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。
（定义）代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。
这样定义代谢工程强调了代谢工程工作目标的确切性。
也就是说，先要找到要进行修饰或要引进的目标生化反应，一旦找准了目标，就用已建立的分子生物学技术去扩增、去抑制或删除、去传递相应的基因或酶，或者解除对相应的基因或酶调节，而广义的DNA重组只是常规地应用于不同步骤中，以便于达到这些目标。
（代谢工程工作目标的确切性及解释）⏹优势尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定向的含义，但与随机诱变育种相比较，在代谢工程中工作计划的定向性更加集中,更加有针对性。
这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。
⏹代谢工程的主要目标：是识别特定的遗传操作和环境条件的控制，以增强生物技术过程的产率及生产能力，或对细胞性质进行总体改性。
载流途径：在一定的生理条件下，生物细胞的代谢物质在代谢网络中流经的主要途径。
独立型网络由主要节点流出的代谢物不能完全合成终端产物。
依赖型网络如果网络或亚网络中的每一节点都依照化学计量规则将代谢物转化为终端产物的组成部分。
⏹代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅在解释细胞生理特性上具有重要的科学意义，而且其潜在的应用跨越了生物技术的全部领域，主要包括：(1)异源蛋白的生产；(2)扩大底物利用范围；(3)生产原来不存在的新物质；(4)对环境有害物质的降解；(5)提高菌体对环境的适应能力；(6)阻断或降低副产物的生成；(7)代谢产品生产速率和生产能力的提高；(8)植物代谢工程；(9)动物代谢工程；(10)人体和组织代谢工程----人类疾病诊断和基因治疗。
代谢工程PDF
代谢工程PDF随着生物技术和计算机技术的快速发展，代谢工程作为一种新兴的交叉学科，正在逐渐成为生物制造业的重要组成部分。
代谢工程是一种利用生物体代谢产生的化合物作为生产目标的技术，通过对代谢通路的优化和调控，实现化合物的高效生产。
代谢工程的发展离不开计算机技术的支持，PDF文件作为一种常用的电子文档格式，也为代谢工程的研究和应用提供了便利。
代谢工程的基本原理代谢工程的基本原理是通过对生物体代谢通路的优化和调控，实现化合物的高效生产。
代谢通路是生物体内多种代谢反应的有机组合，包括代谢途径、代谢途径之间的相互作用以及调控机制等。
代谢工程的目标是通过对代谢通路的调控，使生物体产生更多的目标产品，同时减少副产物的产生。
代谢工程的应用代谢工程在生物制造业中有广泛的应用，其中最为典型的是药物和化学品的生产。
通过对代谢通路的优化和调控，可以实现对目标化合物的高效生产。
例如，青霉素的生产就是一个代谢工程的经典案例。
青霉素是一种重要的抗生素，其生产过程需要大量的生物反应器和复杂的代谢通路调控。
通过代谢工程的优化和改良，可以实现青霉素的高效生产，提高生产效率和质量，同时降低生产成本。
代谢工程的挑战代谢工程作为一种新兴的交叉学科，仍然存在许多挑战。
其中最大的挑战是如何实现代谢通路的高效调控。
代谢通路的复杂性和变异性使得其难以预测和控制。
此外，代谢工程还面临着生物安全和环境保护等方面的挑战。
如何确保生产过程的安全性和环境友好性，也是代谢工程需要面对的重要问题。
PDF文件在代谢工程中的应用PDF文件作为一种常用的电子文档格式，具有方便、易用、可靠等优点，已经成为代谢工程研究和应用中不可或缺的一部分。
首先，PDF文件可以用于存储和共享代谢通路数据和分析结果。
代谢通路的数据和分析结果通常需要进行大量的计算和分析，PDF文件可以方便地存储和共享这些数据和结果，从而方便研究人员进行交流和合作。
其次，PDF文件可以用于发布和传播代谢工程研究成果。
代谢工程
代谢工程之利用谷氨酸棒状杆菌来生产L-精氨酸精氨酸是一种为不同工业和医疗产品所应用的重要的氨基酸。
这里我们报道了代谢工程中利用谷氨酸棒状杆菌来生产精氨酸的改进方法。
首先进行的是随机诱变，来增加谷氨酸棒状杆菌对精氨酸类似物的耐受性。
接下来进行是系统性的代谢工程来进一步对菌株进行改良。
涉及精氨酸操纵子调控阻遏物的去除，NADPH水平的最优化，破坏L-谷氨酸的生成来增加精氨酸的前体物质还有限制精氨酸合成反应的通量优化。
最终菌株的流加培养发酵在5L和大规模1500L的生物反应器中进行，分别允许生产92.5g/L和81.2g/L的精氨酸，产量为每g 碳源（葡萄糖加蔗糖）可分别产出0.40g和0.35g精氨酸。
这里描述的系统代谢工程结构对于构建棒状杆菌菌株来进行精氨酸及相关产品的工业生产是有用的。
L-精氨酸是一种工业中重要的半必需氨基酸，它在食品和补加健康食品、制药以及化妆品中有很多应用。
与其他的氨基酸和有价值的化学物质相比，利用谷氨酸棒状杆菌作为精氨酸生产工程菌有很大优势，因为它带有强烈的面向L-谷氨酸形成的通量。
跟大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌不含有argA和argE基因，但取而代之，它含有可以编码乙酰转移酶的argJ基因，可以催化两种不同的精氨酸生物合成途径的生化反应。
重要的是，谷氨酸棒状杆菌缺乏精氨酸降解酶以及在大肠杆菌中发现的精氨酸脱氨酶，因此，细胞内生产的精氨酸不能被积极地降解。
可被谷氨酸棒状杆菌利用的碳源范围也相对广阔，包括己糖和戊糖两种。
对于精氨酸的过度生产来说，调节子对精氨酸生物合成操纵子的抑制以及精氨酸对乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制在谷氨酸棒状杆菌中被显著地移除了。
在这次研究中，我们针对谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831菌株进行代谢工程研究，最初经过随机诱变来增强精氨酸的产量。
逐步地合理地代谢工程建立在针对通过菌株工程步骤实现的精氨酸产量逐步增加的代谢结果的分析的基础上。
由本次研究建立的最终菌株的流加培养获得了有效的精氨酸产量，使用5L和大规模1500L生物反应器使浓度分别达到92.5和81.2g/L。
代谢工程
通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
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三、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段 。代谢途径的复杂性给检测分析带来不少 麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上 阻碍了它的应用。
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(1)改变代谢途径方法 加速限速反应
增加限速酶的表达量，来提高产物 产率。然而限速酶反应的改变可能会给 整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向
提高代谢分支点某一分支代谢途径 酶活力，使其在与其它的分支代谢途径 的竞争中占据优势，从而提高目的代谢 产物的产量。
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(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因
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1 代谢网络理论
• 代谢网络理论把细胞的生化反应以网络 整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网 络由上万种酶催化的系列反应系统、膜 传递系统、信号传递系统组成，并且既 受精密调节，又彼此互相协调。
• 各种代谢都不是孤立进行的，而是相互 作用、相互转化、相互制约的一套完整 、统一、灵敏的调节系统。
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代谢中间产物作为生物合成的前体及 能量供应者，转向终产物的碳流的大小将 最终决定终产物的产率。中间代谢产物的 代谢流改变会受到细胞的抑制，并引起胞 内功能的严重改变。传统的代谢工程对中 间产物的生理作用考虑较少，从而使产率 远远达不到所计算的理论最大产率。
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• 弹性系数和流量控制系数是代谢控制分 析研究的两个主要指标。
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4 代谢工程的研究手段
• 代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工 程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技 术方面主要有下列三大常用手段： (1)检测技术 常规的化学和生物化学检测手段都可用于 代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的 物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反 应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定 同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的 光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和 气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些 检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态， 并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠 的原始数据。
生物中的碳循环与代谢
生物中的碳循环与代谢碳是地球上最重要的元素之一，它构成了所有生命体物质的基础，也是全球最大的碳汇之一。
碳循环是指碳在地球上不同环境中的流转，包括地面、海洋、大气和生物体内。
生物体内的碳循环被称为生物质碳循环。
生物质碳循环生物体内的碳循环是一个复杂的过程，它的核心在于光合作用和呼吸作用。
光合作用是生物体内最重要的化学作用之一，它是把二氧化碳、水和光合色素催化下的光能转化为有机物质的过程。
利用这种方法，绿色植物能够从阳光中获取能量和原材料，生产出葡萄糖和氧气，这种过程被称为光合作用。
光合作用通过碳循环与呼吸作用密切联系。
光合作用后，生物体在进行呼吸作用时将葡萄糖和其他有机物质分解成二氧化碳和水，并释放出能量。
有机物质分解的过程不仅提供了能量，同时也释放了碳，供其他生物利用，形成了生物质碳循环。
生态系统中的碳循环除了生物体内的碳循环，碳还存在于生态系统中的不同部分，包括土壤、水、植物、动物和大气。
生态系统中的碳循环是一个全球性的过程，从大气中的二氧化碳进入生态系统中后，经过植物或海洋生物吸收，再通过动物或微生物的生物质代谢过程释放出来。
这种过程包括了土壤中有机质分解、植物光合作用吸收和放出碳、大气和海洋之间的碳交换等。
生态系统中碳循环的变化会对全球气候产生影响。
人类活动不断增加了大气中的温室气体，包括二氧化碳、甲烷和氧化亚氮。
这些气体会使地球温度升高，引起气候变化和环境问题。
碳循环的变化与气候变化息息相关，科学家需要不断研究和监测碳循环的变化，以便更好地控制和应对气候变化。
生物体内的碳代谢碳代谢是生物体内的重要代谢过程之一，它包括了糖的分解、有机酸的合成、脂肪酸合成等。
碳代谢的过程与生物体内的其他代谢过程紧密相连，如蛋白质代谢、核酸代谢等。
糖类代谢是生物体内碳代谢的核心部分，它包括了糖的分解、糖的转化为脂肪酸或糖原、糖的合成等。
这些过程是生物体维持能量和物质平衡的核心之一。
糖的分解和合成过程通过多种途径控制，包括基因调控和代谢调控等。
《代谢工程》课件
代谢工程是一门新兴的交叉学科，通过对微生物、动植物和细胞的基因、代 谢及代谢物的分析，设计高效合成代谢通路，以达到所需的代谢产物。本次 PPT将介绍代谢工程的应用场景、发展历程、工具、调控和优化、应用以及 未来挑战等内容。
代谢通路的分析
构成和运作
代谢通路是由一系列化学反应 组成的，负责产生细胞所需的 能量和化学物质，并维持正常 的代谢活动。了解其组成和运 作方式，有助于制造更高产和 更理想的化合物。
代谢调控和优化
调控的重要性
了解代谢通路的调控机制及其在微生物代谢工程中的应用，提高产量和纯度，优化代谢通路 的构建结果。
优化的策略和方法
包括调节基因表达、代谢物浓度或添加外源物质等多种策略和技术，帮助提高代谢产物的产 量和质量。
实例分析：代谢通路的优化案例
如利用代谢通路工程提高盐酸紫杉醇的产量和质量，使得该化合物的生产与应用在医药领域 中得到了Biblioteka 泛的应用。代谢工程的挑战和机遇
1 挑战
代谢通路的调控、代谢物检测的精准测定、代谢工程和产业化生产的时间和成本。
2 机遇和发展趋势
通过合成代谢和基因组编写等技术，可以实现微生物的全新合成，同时伴随良好的规范 管理以及营销技巧，能够为使用者带来更多实际的应用效果。
3 作用与意义
代谢工程在新药研发、微生物生产等重要领域中，具有不可替代的作用，将为我国相关 产业的进步和人民健康的发展做出重要贡献。
变异和进化
代谢通路具有很高的变异和进 化能力，其表现为同一菌种或 种间的表型差异。了解代谢通 路的变异和进化，有助于更好 地设计合成代谢通路，生产更 多、更为理想的化合物。
特点和研究对象
代谢通路是生物体内最活跃的 部分之一，其主要特点是反应 复杂，条件严格，需要满足严 谨的反应平衡。了解代谢通路 的特点和研究对象，有助于更 好地参与代谢工程的实践。
代谢工程的基本概念
限制性遗传信息之谜
微生物代谢工程
代谢流及其控制的分析
微生物细胞能为其自身提供代谢能 微生物细胞的生存方式与动物、植物等高等生物的细胞不同，微生物细胞能独立存在、自主生活。因此每个微生物细胞都具有能量转换机构，这种机构可把其它形式的能量转换成能被其自身直接使用的能量(如 ATP、GTP 和储存在膜上的质子运动势 ΔP )，暂且把它们称为代谢能。在代谢能的直接支撑下，活细胞才能维持其高度有序的状态。
细胞能量转换机构的组成 微生物细胞的能量转换机构包括：需要代谢能来激活的代谢途径的有关的酶和这些酶的辅酶、原核微生物的细胞质膜和真核微生物线粒体的内膜，以及这些膜上的电子传递链和ATP酶，还有在能量代谢和主动输送中起辅助作用的有关载体系统。
微生物细胞代谢的电子流和电子回路 工业发酵普遍使用的化能异养型微生物靠生物氧化把化学能转化为可被微生物直接利用的代谢能。微生物细胞的生物氧化过程必须借助于辅酶，并且其生物氧化过程和跨膜的主动输送过程伴随着电子(或质子)的流动，形成微生物代谢的跨膜的质子回路。
1
进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；
2
通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；
3
节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；
4
堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；
5
出，促进目的产物向胞外空间分泌。
代谢网络的节点及其刚性 微生物代谢网络中的途径的交叉点(代谢流的集散处)叫做节点(node)，微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用 “ 五字策略 ” 制订育种方案时必须认真考虑节点刚性问题，尽量采用解除反馈调节的育种手段。
代谢工程概念
代谢工程概念一、名词解释：1代谢工程：应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。
代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。
它属于基因工程的一个重要的分支。
2代谢控制发酵技术：利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵。
3生物技术：是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。
4代谢网络的节点（Node）：微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）称作节点。
在不同条件下，代谢流分布变化较大的节点称为主节点。
根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、弱刚性、强刚性三种。
5柔性节点（Flexible Node）：是节点的一种类型，是流量分配容易改变并满足代谢需求的一类节点。
（指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加）。
6强刚性节点：若一个节点的一个或多个分支途径的流量分割率受到严格控制，那么这类节点就称为强刚性节点。
（指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。
）。
7弱刚性节点：若一个节点的流量分配由它的某一分支途径的分支动力学所控制，则称该节点是弱刚性节点，介于柔性节点和强刚性节点之间。
8代谢流（Flux）：定义为流入代谢物被途径加工成流出代谢物的速率。
9途径工程（Pathway Engineering）：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。
10合成生物学：简单地说，合成生物学是通过设计和构建自然界中不存在的人工生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题的一门新兴学科。
微生物名词解释
名词解释发酵工程:是利用微生物的生长代谢活动来生产各种有用生物化学产品的技术过程。
代谢调节：是指在代谢途径水平上酶活性和酶合成（酶量）的调节。
组成酶：细胞内总是适量存在的，不依赖于酶底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。
诱导酶：依赖于酶底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。
其基因以隐性状态存在于染色体中。
分解代谢物阻遏：微生物与容易同化的碳源或氮源相接触，使有些酶的合成速率相对降低的作用。
反馈阻遏：生物合成途径的终点代谢产物极其衍生物在转录的水平上抑制该途径的所有酶的生物合成。
反馈抑制：是微生物细胞中变构调节的典型方式，因此非常重要，应用广泛。
概念：生物合成途径的最终代谢产物抑制该途径的前面第一或第二个酶的催化活性。
通过变构调节进行抑制初级代谢产物：是微生物在生长过程中产生的、为菌体生长所必须的小分子化合物，包括单糖、氨基酸、核苷酸维生素以及用来合成这些物质的小分子物质。
次级代谢产物：又称次生代谢产物或分化代谢物，是由微生物在生长后期产生的，为菌体生长非必须但对产生菌的生存具有一定价值的，分子结构相对复杂的小分子化合物。
操纵子：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。
转录的功能单位。
很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。
操纵基因：操纵子中与阻遏物结合的一段特定核苷酸序列。
对相邻的结构基因的转录活动有控制作用。
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
原生质体：在高渗溶液中出去细胞壁的细胞。
培养基：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
糖化：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖。
前体物质：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。
在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。
微生物应用技术-代谢工程
微生物技术应用——代谢工程
代谢工程定义：利用重组DNA技术或其他技术， 有目的地改变生物中已有的代谢网络和表达 调控网络，以更好地理解和利用细胞的代谢 途径，并用于化学转化、能量转移及大分子 装配过程。
➢代谢工程就是利用基因工程技术重新设计代谢系统。 ➢“一种理解并利用代谢过程的方法”。
微生物技术应用——代谢工程
一、代谢工程的产生及沿革
1 半个多世纪微生物生理与育种知识的累积 2 基因工程理论和技术的成熟 3 代谢流定量分析技术的发展 4 生化工程在线检测和建模方法的发展
微生物技术应用——代谢工程
1 半个多世纪微生物生理与育种知识的累积
微生物生理学、遗传育种学和生物化学的发展
用代谢途径操作的手段来改造微生物以获 得期望的性质
19.正常代谢和竞争型细胞经济
微生物在生存竞争中进化的方向是发展其 自身的适应能力和提高细胞运行的经济系数。 经生存竞争而幸存下来的野生型微生物在其所 栖身的环境中是富有竞争能力的，并且它们的 代谢中间物在代谢网络中的分布及细胞经济运 行状况有利于细胞生长、繁殖和在竞争中获胜。 在上述条件下，细胞处于正常代谢状态，细胞 经济体系呈现竞争型细胞经济的特色。
21.细胞经济受到严格的制约
工业发酵依靠细胞群体的代谢来获得产品， 导向型细胞经济固然有利于特定的代谢产物的 生产，但竞争型细胞经济向导向型细胞经济的 转化受到能量代谢、还原力的平衡等条件的严 格制约（以保证有熵的输出），表现出代谢网 络的刚性。若细胞经济实体的运行状态过度偏 离竞争型运行状态，活细胞的高度有序状态将 走向无序，最终导致细胞经济的崩溃。
11.代谢主流的变动性和选择性
微生物的代谢主流的方向、流量甚至 所流经的途径都可能发生变化。这就是微
生物工艺学第二章 微生物代谢调节及其在工业生产中的应用
工业发酵的五字策略
在“ 载流路径 ” 、“ 代谢主流 ” 和“ 五段 式 ” 等概念的基础上，从统筹的角度出 发，提出能作为一个整体用于设计育种以及 发酵工艺控制的五字策略 ： \进 \通 \节 \堵 \出
①进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；
②通，使来自上游和各个注入分支的碳架物 质能畅通地流向目的产物；
五 初级代谢产物的代谢调节
1 初级代谢： 能使营养物质转变成机体的结构物质和对机
体具有生理活性作用的物质或是为机体生长 提供能量的一类代谢； 产物有单糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白质、核 酸、多糖、脂类等； 普遍存在于生物中的代谢类型，合成障碍， 引起生长停止，甚至死亡。
2 提高初级代谢产物产量的方法：
研究代谢工程的目的：精确地处理好微生物 细胞自身的利益与人类对微生物细胞提出的 要求之间的对立与统一的关系。
微生物生物工程的难题
既然微生物的代谢主流对网络中的途径有 自主的选择性，而工业发酵的目标又是要 微生物的代谢主流经理想载流途径，流到 目的产物，因此就有必要去解决理想载流 途径的设计问题和对代谢主流的合理导向 问题。
（7）改变细胞膜的通透性
理论基础：细胞内形成的代谢产物排出细胞 时，也与细胞膜的结构有关；
当控制物理、化学条件或者筛选细胞膜、细胞 壁结构组成的突变株以改进物质的进出速率， 影响代谢过程时，都有可能造成代谢产物的过 量生产；
例子：谷氨酸生产。
（8）筛选抗生素抗性突变株
一些主要抗生素的作用机制已比较清楚，筛选抗 生素抗性突变体——改变代谢调节——获得过量 生产。
②带实心箭头的虚线标示阻遏。
1 影响酶活性的调节模式（共 11 种）
①只有一个终端产物的（没有分支的）途径的 调节模式（共 3 种）
代谢工程重点整理
代谢工程重点整理一、名词解释1、柔性节点(flexible node)：若流入每一分支的流量容易改变以满足需求，这样的节点称为柔性节点。
（在柔性节点，导向每一分支的酶对节点代谢物的亲和性相近似，每个分支的反应速度也相近，每一分支的流量受相应的终端产物反馈抑制控制。
）2、刚性节点：若一个节点的一个或多个分支的分配率被严密控制，则称该节点是强刚性的，即刚性节点。
（这种控制通常是通过反馈控制和一个代谢物对另一个分支的酶的交叉激活这两种作用的结合来实现的。
）3、反馈抑制（feedback inhibition）：也称负反馈，这是生物体普遍存在的一种调节机制，反馈抑制是指反应终产物对自身合成途径中的酶活力起抑制作用，大多是对第一个酶的活力起抑制作用。
4、反馈阻遏：末端代谢产物阻止整个代谢途径酶的合成作用。
5、代谢组学：一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。
它所关注的是相对分子质量为1,000以下的小分子。
6、拟稳态假设：7、超定系统和不定系统：AX(t)=0，如果方程数等于反应速率数目（代谢通量），方程有唯一确定解，称为正定系统。
如果方程数小于反应速率数目（代谢通量），方程有无数解或不确定解，称为不定系统。
如果方程数大于反应速率数目，称为超定系统。
如果已测量的通量的个数小于系统的自由度，刚对网络通量存在无数个解----不定系统，这时如果能够规定一个合适的目标函数（例如使比生长速率最大这样的目标函数），那么就能利用线性规划来确定胞内通量分布。
8、比较基因组学（Comparative genomics）：在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因的结构进行比较，了解基因的功能、表达调控机制和物种进化过程的学科。
9、基因尺度的代谢网络构建：代谢网络模型的构建包含有序地收集生物系统内所有基因、蛋白质、生物化学反应的信息的过程，然后通过系统限制条件用数学方程将重构信息表达出来，从而将信息转化为模型。
代谢工程
代谢工程：（部分）把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。
代谢工程与随机诱变育种的优势：在代谢工程中工作计划的定向性更加集中,更加有针对性。
这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。
代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅在解释细胞生理特性上具有重要的科学意义，而且其潜在的应用跨越了生物技术的全部领域，主要包括：(1)异源蛋白的生产；(2)扩大底物利用范围；(3)生产原来不存在的新物质；(4)对环境有害物质的降解；(5)提高菌体对环境的适应能力；(6)阻断或降低副产物的生成；(7)代谢产品生产速率和生产能力的提高；(8)植物代谢工程；(9)动物代谢工程；(10)人体和组织代谢工程一人类疾病诊断和基因治疗。
代谢途径是将一组特定的流入和流出代谢物质联系在一起的一个生化反应序列。
代谢流(物流/通量)(flux)：流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。
代谢网络可视为由若干个串联或并联的简单子途径组成，它们通过节点相连。
节点分为柔性、强刚性及弱刚性节点三类。
柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。
强刚性节点:是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。
弱刚性节点:介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。
代谢物流分析：一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。
代谢控制分析:物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比其他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。
代谢工程概述课件
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18
3、研究生物合成机制的常用方法 （1）刺激实验法 （2）同位素示踪法 （3）洗涤菌丝悬浮法 （4）无细胞抽提法 （5）遗传特性诱变法
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• 刺激实验法：在发酵培养基中，加入某些可能是 前体的物质，观察该物质在发酵过程中的被利用 情况与促进目的产物生成的效果。
• 洗涤菌丝法（或称静息细胞法）：取不同生长阶 段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分及代谢产 物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定 条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对 产物合成的影响。
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• 3、数学及计算机工具：研究代谢工程不仅需要遗 传学知识，而且需要对寄主菌的生化代谢途径和 生理学有深入的理解，所以将DNA数据库的信息 应用于代谢工程并开发出适合的软件系统是十分 必要的，Karp等构建了981个生命体化合物数据库， 为未来的发展奠定了基础。人们已在实验的基础
代谢工程
( Metabolic Engineering )
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1
第一节 代谢工程概述
现代生物技术手段主要包括：
• 基因工程 (Gene Engineering) • 细胞工程 (Cell Engineering) • 发酵工程 (Fermentation Engineering) • 酶工程 (Enzyme Engineering)
• （1）1988年MacQuitty指出，微生物途径工程 (Microbial Pathway engineering)是利用DNA重 组技术修饰各种代谢途径（包括生物体非固有 的代谢途径），提高特定代谢物的产量。
• （ 2 ） 1991 年 Bailey 将 代 谢 工 程 (Metabolic engineering)定义为：利用DNA重组技术优化细 胞的酶活、转运和调控功能，提高细胞活力。
代谢工程概述-PPT
• 现代生物技术在化工、医药卫生、农林牧渔、轻 工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用， 可促进传统产业的改造和新型产业的形成，对人 类社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术 的重要组成部分，是生物技术转化成产品的重要 环节。
• 20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速，被视为
继传统的蛋白质多肽单基因表达（第一代基因工 程）、基因定向突变（第二代基因工程）之后的
4）胞内代谢物 是细胞内其他化合物，包括不同 代谢途径的中间代谢物和用于大分子合成的结构 单元等。
离心途径
碳架物质从向心板块注入中心板块时所流经的代谢途径统称向心途径。在工业
发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质(一 般要经胞外酶降解后)从培养介质跨膜进入细胞，(一般要)经过“向心途径” 、“中心途径”和“离心途径”等连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目 的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质中。
• （ 8 ） 1999 年 Koffasl 将 代 谢 工 程 (Metabolic Engineering)定义：利用分子生物学原理系统分析 代谢途径，设计合理的遗传修饰战略从而优化细 胞生物学特性。
• 代谢工程较系统的定义
应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传 学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功 能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以 改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代 谢活性的实现）。 简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有 目的的修饰。
• 代谢工程的理论首先由Jay Bailey于1991年 在“Science”杂志上论述了代谢工程的应 用、潜力和设计。
• 同年，Greg Stephanopoulos和Joseph Vallino 在“Science”杂志上论述了有关“过量生 产代谢产物时的代谢工程”、“代谢网络 的刚性、代谢流的分配、关键分叉点及速 度限制步骤”等内容。
碳代谢中的重要代谢物
碳代谢中的重要代谢物
碳代谢涉及多种代谢产物，其中一些重要的包括：
1. ATP（腺苷三磷酸）：ATP是细胞内能量的主要形式，它在碳代谢过程中通过降解有机物质获得。
2. NADH（还原型辅酶A）：NADH是碳代谢中的重要电子供体，它通过脱氢反应在代谢途径中释放氢原子，并在线粒体呼吸链中产生ATP。
3. Pyruvate（丙酮酸）：丙酮酸是糖酵解过程中葡萄糖分解生
成的重要产物，它可以通过进一步的代谢进入乳酸发酵或进入线粒体进行氧化解酸过程。
4. Acetyl-CoA（乙酰辅酶A）：乙酰辅酶A是脂肪酸β氧化和某些氨基酸的代谢产物，它可以进入三羧酸循环用于产生能量。
5. Glucose（葡萄糖）：葡萄糖是碳代谢的主要底物，它可以
通过糖酵解、糖异生和糖原代谢等途径产生ATP。
6. CO2（二氧化碳）：二氧化碳是碳代谢中的重要产物，它通过三羧酸循环和呼吸链的反应生成并排出。
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2-16
2.2
●
•
CoA 3
CoA
2.2
●
•
CoA
αCoA
2-17
2.3
●
CoA β-
NADPH
2-18
2.3
●
CoA
2-19
2.3
●
65-
2.4
●
• Metabolic Engineering
•
Metabolic pathway
• • Metabolic network
2.4
●
2.4
2.5
● •
—
酶原 无活性前体 活性酶分子
2-24
2.5
● •
2-25
2.5
●
DNA
2.5
●
1
)
2-26
2.5
●
2
2-27
2.5
●
2.5
● • —
2-28
β-
2.5
● • —
2-29
2.5
● •
2-30
2.6
●
•
2-31
2.6
●
• X1=Vin-VHK X2=VHK-VGAPD-VPol X3=VPEK-VGAPD-0.5VGol X4=2VGAPD-VPK X5=2VGAPD-VPK-Vpol-VPK-VATPase 1,6-
2-7
2.1
●
•
ATP glycolysis
2-8
2.1
●
• 10 2 5 1 2 5 2 ATP 4 ATP 1
CO2
H 2O
2.1
●
•
EPM
COOH C==O CH3
CoASH CO2
O CH3-C-SCoA
CoA
NAD+ NADH+H+
2-9
2.1
●
•
– – – – a– – – – A
●
—
2.1
● —
photosynthesis CO2 O2 nCO2+nH2O H 2S 2H2S+CO2 (CH2O)+H2O+2S (CH2O)n+nO2 H 2O CH2O
n
2.1
●
• chloroplast
—
1-1000
2-1
2.1
●
•
—
2-2
chlorophyll b carotenoid c phycobilin a
—
2H2O+2NADP+
O2+2NADPH+2H+
2.1
●
• ATP
—
2H2O+2NADP+ +3ADP+3Pi
2NADPH+2H++3ATP+O2
2.1
●
•
—
NADPH NADPH ATP
ATP CO2
Calvin 6CO2 + 18ATP + 12NADPH + 12H ++ 12H2O C6H12O6 + 18ADP + 18Pi + 12NADP+
2.4
●
•
2.4
●
•
Michaelis-Menten ——
1 2
log gain
2.4
●
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2.5
2.5
●
2.5
● •
—
2-20
2.5
● •
—
➢
➢
2-21
66-
2-22
2.5
● • —
2-23
磷酸化酶b本身无活性，当磷酸化酶b活性中心的丝氨酸残基被磷 酸化后，即形成高活性磷酸化酶a。 •磷酸化酶b转化被磷酸化酶激酶催化为活性磷酸化酶a •磷酸化酶a去活化（去磷酸化）由另一种磷酸酶催化
2.1
●
• monosaccharide aldose ketose
2-4 D- L-
Fischer
2-5
Fischer
2.1
●
• oligosaccharide 2 10
disaccharide
2-6
2.1
●
• polysaccharide
starch glycogen cellulose inulin chitin hemicellulose
2.1
●
•
—
H 2O O2 [H] ATP ADP+Pi
2C3
CO2 C5 CH2O
2-3 H2O ADP+Pi 2[H]+1/2 O2 ATP6 C3 CO2 : CO2+C5 2 C3 [H],
ATP
2C3 CH2O
ADP+Pi
2.1
●
• photosystem, PS) I(PSI) Ⅱ(PS Ⅱ) photoreaction center PS Ⅱ PS I H2O NADP+
2-10
2.1
●
•
TCA CoA 1 1 NADH TCA 1 CoA 2 CO2 1 ATP 3 NADH 1 FADH2
2-11
1 CO2
2.1
●
• pentose phosphate pathway
-6-
NADPH -552-12
2.1
●
• ED
NADPH
2-13 EDபைடு நூலகம்
2.2
●
• glyceride acylglycerol
1000 2-31
2.6
●
• 2-31
2.6
●
•
( 3.15 4.25)
3.48
2.6
●
2-32 pneumoniae
Klebsiella
2.6
●
1,3-
1,31,31,31,31,3-
●
1. 2. 3. 4. 2,31,3-
5.
2-14
•
fatty acid
2.2
●
•
•
α-
2.2
●
• CoA
O RCH2CH 2C-OH
=
+
CoA-SH
ATP
AMP
O RCH2CH 2C~SCoA ~SCoA PPi
=
CoA
(acyl-CoA synthase) ATP Mg 2+ 2
2.2
●
• CoA CoA β-
2-15
CoA
2.2
●
• 研究生物代谢途径的控制策略 (1)代谢通量分析（Metabolic Flux Analysis, MFA） “ ✓ ”
✓
2-19
2.4
●
• (2) （Metabolic Control Analysis, MCA）
描述代谢网络控制规律的参数： 通量控制系数 测定方法：直接法、间接法、通过瞬变代谢物的测量、 根据动力学模型直接计算、根据大偏差理论计算 浓度控制系数 反映单个酶动力学与通量之间的关系 弹性系数 在系统其他代谢物浓度不变的前提下，由第j个代谢物 浓度的相对变化引起第i个反应速率的相对变化。