微生物学实验技术乳酸菌的分离和纯化

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3）观察记录：在培养基中加入乙醚1~2mL， 经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片 刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁 缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在， 乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应， 否则为阴性反应。
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2.划线分离
挑取单菌落平板划线，置40℃培养48h。挑 选出乳酸菌进行连续6次以上的传代，以达 到提纯。
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（二）鉴别
1吲哚试验
1）试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试 管n+1支，分别标记乳酸菌和空白对照。
2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌 苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照 的不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。
3)灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的 糖溶液0.5mL，则成1%的浓度。
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有关溶液：
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g 溶于100mL乙醇中，贮存于棕色瓶中保 存备用。
吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g， 95%乙醇760mL，浓盐酸160mL。
Baidu Nhomakorabea0%硫酸 2%高锰酸钾
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含氨的硝酸盐溶液：
称取硝酸银2g，蒸馏水100mL，待硝酸银溶 解后，取出10mL备用，向其余的90mL硝酸 银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续 滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止， 再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄 雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失， 继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而 稳定的薄雾状沉淀为止。
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四、操作步骤：
（一）乳酸菌的分离纯化 1.稀释分离 培养基的配制 灭菌 倒平板
制备样品稀释液 接种（涂布法） 培养
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每组准备下列器材（灭菌）
1.培养基 A 溶液（250ml三角瓶，内装125ml） 2.培养基 B 溶液（250ml三角瓶，内装125ml） 3.试管7支（内装9ml水 ） 4.培养皿一包（9个） 5.1ml刻度吸管7支
BGC 牛乳培养基
（A）溶液：脱脂乳粉 100g，水500mL，加入 1.6%溴甲酚绿(B.G.C)乙醇溶液1mL,80℃灭菌 20min。
（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g， pH6.8, 121℃灭菌20min。 以无菌操作趁热将（A）、（B）溶液混合均 匀后倒平板。
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通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该 菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳 链球菌。
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三、实验器材：
➢ 菌种来源：
➢ 市场销售的各种新鲜酸乳
➢ 培养基：
➢ BGC 牛乳培养基 ➢ 乳酸菌培养基 ➢ 蛋白胨水培养基 ➢ 糖发酵培养基
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蛋白胨水培养基1000mL，1.6%溴甲酚 紫乙醇溶液1~2mL，pH：7.6，另配20% 糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10mL。
制法：
1）将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH： 7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的 小玻璃管。
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2）将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的 各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基 121℃灭菌20min，糖溶液112℃灭菌30min。
乳酸菌培养基
牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡 萄糖10g，乳糖5g，氯化钠5g，水 1000mL，pH：6.8； 1.6%溴甲酚绿
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蛋白胨水培养基
蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH： 7.2~7.4
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糖发酵培养基
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1mL
每管各9mL无菌 水
琼脂培养基
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取市售新鲜酸乳稀释至10-6，取其中的10-4、 10-5 、 10-6 3个稀释度的稀释液各0.2mL，分别接 入BGC 牛乳培养基琼脂平板上，用无菌玻璃刮 刀依次涂布，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁 平的黄色菌落及其周围培养基变黄者初步定为 乳酸菌。
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五、结果分析
1.乳酸菌的分离提纯
在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周 围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取 出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两 种形状。
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2.乳酸菌的鉴定
该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有 杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加 入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应
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二、基本原理：
选择适合于待分离微生物的生长条件，造成只利于该 微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰 一些不需要的微生物；加入某种指示剂，使待分离微生 物在培养基中形成具有明显特征的菌落。
微生物在固体培养基上生长形成单个菌落，挑取菌落 平板划线获得纯培养。
2.糖发酵试验
1）试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发 酵培养液试管各n+1支，每种糖发酵试管中 分别标记乳酸菌和空白对照。
2）接种培养：以无菌操作分别接种少量菌 苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液 的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏 小管倒置试管中，置37℃恒温培养箱中培养 24h，观察结果。
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3）观察记录：与对照管比较，若接种培养 液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果 培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中 的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管 内没有气泡为阴性反应。
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3.乳酸的检测
选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发 酵液的上清液约10mL于试管中，加入10% 硫酸1mL，再加2%高锰酸钾1mL，此时乳 酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液 中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试 管至沸，观察滤纸变化。