呼吸道感染病原体IgM九联检

重 庆 医 科 大 学
本科生毕业论文
论文题目 呼吸道感染病原体IgM 九联检
作者姓名
论文答辩年月 2015年6月
2015 年 6 月
指导教师姓名（职称、单位名称）
副主任检验师
新疆乌鲁木齐自治区人民医院
目录
中文摘要 (2)
Abstract (3)
论文正文 (4)
前言 (4)
1 材料与方法 (5)
1.1 实验对象 (5)
1.2 实验原理 (5)
1.3 实验过程 (6)
1.3.1 实验用品 (6)
1.3.2 操作过程 (6)
2 结果判断 (7)
2.1 有效性判断 (7)
2.2 样本结果判断 (8)
3 实验统计 (8)
4 结论 (10)
讨论 (10)
参考文献 (11)
开题报告 (13)
致谢 (14)
呼吸道感染病原体IgM九联检
摘要
目的了解呼吸道感染病原体IgM九联检对疑似呼吸道患者的确诊意义，及联检这种检测方式对临床产生的筛查与指导意义。

方法收集所处医院2014年7月到2015年5月在医院门诊、病房诊断为呼吸道感染的患者标本，采用间接免疫荧光法，测定患者血清中上述九种病原特异性IgM抗体。

采用EXECL2003和SPSS13.0软件，分析九种病原体感染在小儿呼吸道感染者中的年龄分布情况以及感染发生的季节特点。

并简单的对其成人与儿童的感染情况做个对比，以观察儿童与成人之间的感染是否有关联或是相似。

结果呼吸道感染患儿中，九种病原特异性IgM抗体总阳性率为26.97%（328/1216），肺炎支原体为18.26%（222/1216），沙眼衣原体为0.16%（2/1216），呼吸道合胞病毒为1.40%（17/1216），腺病毒为0.33%（4/1216），甲型流感病毒为0.25%（3/1216），乙型流感病毒为4.28%（52/1216），副流感病毒1型、2型和3型为0.66%（8/1216），Q热立克次体为0.33%（4/1216），嗜肺军团菌为1.32%（16/1216）。

肺炎支原体IgM 抗体阳性率明显高于其它病原体（2x=1527.967, P<0.01）。

九种病原总检出率秋冬季高于春夏季（2x=12.184, P<0.01）。

3岁以上儿童组肺炎支原体检出率明显高于其它年龄组（2x=57.923, P<0.01）。

而成人亦是如此，肺炎支原体IgM抗体阳性率明显高于其它病原体。

与儿童的感染情况相似。

结论乌鲁木齐地区小儿呼吸道感染者中，肺炎支原体感染达18.26%，尤其以3岁以上儿童多见；其次为乙型流感病毒感染占4.28%，而呼吸道合胞病毒感染占1.40%。

呼吸道感染患儿中九种病原体检出率秋冬季高于春夏季。

且成人亦然。

关键词：乌鲁木齐地区；呼吸道感染；儿童；成人；病原；九联检
RESPIRATORY TRACT INFECTION PATHOGENS IgM
NINE JOINT INSPECTION
ABSTRACT
Objective To study the respiratory tract infection pathogens IgM nine joint inspection diagnosis significance in patients with suspected respiratory tract, and the joint inspection the test way for clinical screening and guiding significance. Methods To collect at the hospital in July 2014 to May 2014 in the hospital outpatient service and ward diagnosis for patients with respiratory infections specimens, using indirect immunofluorescence method, determination of the nine kinds of pathogenic specific IgM antibody in serum. EXECL2003 and SPSS13.0 software, analysis of nine kinds of pathogen infection in children with respiratory tract infection in the distribution of age, sex, nationality, etc, and the seasonal characteristics of infections. And simple for the infection situation of adult and the child do a contrast, children and adults to see whether the infection between the related or similar. Results In children with respiratory tract infection, and nine kinds of pathogenic specific IgM antibody total positive rate was 26.97% (328/1216), mycoplasma pneumoniae was 18.26% (222/1216), chlamydia trachomatis was 0.16% (2/1216), respiratory syncytial virus was 1.40% (17/1216), adenovirus was 0.33% (4/1216), influenza a virus was 0.25% (3/1216), influenza b virus was 4.28% (52/1216), influenza virus type 1, type 2 and type 3 was 0.66% (8/1216), Q fever patients was 0.33% (4/1216), eosinophilic lung legionella bacteria was 1.32% (16/1216).Mycoplasma pneumoniae IgM antibody positive rate was obviously higher than other pathogens (= 1527.967, P < 0.01). Nine kinds of pathogen detection rate always fall and winter than spring and summer (= 12.184, P < 0.01). Above 3 years old children series mycoplasma pneumoniae was much higher than other age groups (= 57.923, P < 0.01). And adults are, mycoplasma pneumoniae IgM antibody positive. Conclusion urumqi region in children with respiratory tract infections, mycoplasma pneumoniae infection was 18.26%, especially for more than 3 years of age or older children to see; Followed by hepatitis b virus infection (4.28%), and respiratory syncytial virus infection accounted for 1.40%. Nine kinds of pathogen detection rate in children with respiratory tract infection, autumn and winter than spring and summer. And adults.
Keywords:the area of Wulumuqi；respiratory tract infections；children；adults;pathogens；nine joint inspection
呼吸道感染病原体IgM九联检
呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染。

上呼吸道感染是指自鼻腔至喉部之间的急性炎症的总称，是最常见的感染性疾病。

下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。

上呼吸道感染90%左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。

该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播。

常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌，迅速生长繁殖，导致感染。

该病预后良好，有自限性，一般5-7天痊愈。

常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。

下呼吸道感染临床上供选择的抗生素日益增多，耐药菌株亦明显增多，由于大剂量头孢菌素的应用，导致院内感染特别是假单孢铜绿杆菌和肠球菌感染日益增多。

血清学和分子生物学研究的进展，使人们对支原体、衣原体感染或军团菌感染的认识有很大提高。

氟喹诺酮类、大环内酯类等已引起人们重视。

无论是下呼吸道感染还是上呼吸道感染，绝大部分是由病毒引起的，称为：病毒性呼吸道感染。

多种病毒引起的急性呼吸道感染。

分病毒性上呼吸道感染和病毒性下呼吸道感染，前者表现为急性鼻炎、咽炎和喉炎，后者表现为急性气管炎、支气管炎和肺炎。

本类疾病发病率高，人群普遍易染，小儿、老人、营养不良及患有慢性病者更易患病。

以冬春季发病较多。

不少呼吸道传染病如麻疹、风疹等可表现为上呼吸道感染症状，应注意鉴别上呼吸道感染和下呼吸道感染。

因此，为了解乌鲁木齐地区小儿呼吸道感染者中，肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae, MP)，沙眼衣原体(Chlamydia Pneumoniae, CP)，呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)，腺病毒(Adenovirus, ADV)，甲型流感病毒(Influenza virus A, IV A)，乙型流感病毒(Influenza virus B, IVB)，副流感病毒1、2和3型(Parainfluenza virus 1、2、3, PIV 1、2、3)，Q热立克次体（Coxiella burneti, COX），嗜肺军团菌（Legionella pneumophila, LP），感染状况，本研究对乌鲁木齐地区1216例呼吸道感染小儿，进行了上述九种病原体特异性IgM抗体的联合检测，并对结果进行了分析讨论。

而且九项呼吸道联检试剂(间接免疫荧光法)检测快速、操作简便、准确性高,检测范
围广、利于早期发现,费用不高,适合各大医院推广应用。

1 材料与方法
1.1 实验对象
需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。

使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。

血清样本采集后如不在8小时内检测应2~8 ºC冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20ºC）保存。

不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。

不要使用高血脂或污染的血清。

若样本中含有微粒要离心使之澄清。

1.2 实验原理
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ），是标记免疫技术中发展最早的一种。

它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。

由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。

免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下下呈现一种特异性荧光反应。

间接免疫荧光法如检查未知抗体，先用待检血清（第一抗体）与已知抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。

检查未知抗原，则表明抗体是已知的。

样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。

在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。

用免疫荧光显微镜观察结果。

1.3 实验过程
1.3.1 实验用品
呼吸道感染病原体IgM九联检试剂盒；精确的微量移液器；恒温培养箱；蒸馏水；24x60 mm盖玻片；湿盒；水平摇床；荧光显微镜以及制造商推荐的滤光片。

1.3.2 操作过程
1、实验前准备:只有PBS洗液需要预先配制。

将试剂2 中的成分加入1L蒸馏水中，摇匀直止完全溶解。

配好后储存在2-8ºC。

2、实验步骤：1）使用前，将所有试剂平衡至室温。

载玻片平衡至室温后再打开。

2）样本的稀释：按1:1比例稀释血清样本，即25µL血清加入25µL PBS中。

阴阳性对照不需要稀释。

3）用抗人IgG吸附剂处理稀释后的血清：将30µL稀释后的血清加入150µL吸附剂中，彻底混匀。

阴阳性对照不需吸附剂处理。

处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。

4）在载玻片1 的每孔中加15µL吸附剂处理过的血清（一份样本对应一个载玻片）。

在一个载玻片的每孔中加入15µL不稀释的阳性对照，在另一个载玻片的每孔中加入15µL不稀释的阴性对照。

5）将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。

6）用PBS 的缓慢水流冲洗载玻片（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS 中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。

再用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。

7）载玻片自然晾干。

8）每孔加入15µL抗人IgM FITC结合物溶液（不需稀释）。

9）将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。

10）重复6和7的洗涤步骤。

11）加几小滴封闭介质，小心盖上盖玻片。

12）尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。

如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8ºC不超过24小时[1-4]。

3、注意事项：1)仅使用试剂盒内的组分，不要混用不同试剂盒或不同厂家的试剂
组分。

2) 每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。

3) 包装如有损坏请勿使用。

4) 切勿用嘴吸移液管加样。

5) 本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人源性物质。

尽管本试剂盒中的人血清质控品已经测试为HBsAg、HCV抗体和HIV抗体阴性，质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。

孔内包被的经灭活的嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型，也仍应视为具有潜在感染性并小心处置。

目前没有方法可以确保这些或其他感染性物质不存在，因此所有的材料应视为具有潜在感染性进行处置，应遵守当地关于临床废弃物处理的法规。

6) 结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度＜0.1%），避免接触酸和重金属。

7) 封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在高温下。

8) 伊文斯蓝（浓度＜0.1%）是一种致癌物。

请勿接触皮肤和眼睛。

万一接触到该溶液，用水彻底冲洗并到医院检查。

9). 仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。

载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。

11）显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。

12）不要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。

13）每个载玻片只能使用一次。

不要分割，也不要再使用没有用过的孔。

14）试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。

15）吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。

2 结果判断
2.1 有效性判断
每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。

观察到的荧光模式应为：1）阳性对照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核、胞浆或胞膜荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光；支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。

2）阴性对照：军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒
和副流感病毒的细胞呈现红色。

2.2 样本结果判断
阳性结果：可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。

阴性结果：可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色[1-4]。

3 实验统计
采用EXECL2003和SPSS13.0软件进行数据处理，多个样本间的阳性率比较采用R ×C 表的卡方检验，两个样本间的阳性率比较采用四格表的卡方检验，以（P<0.05）为差异有统计学意义。

实验数据统计：
表1 不同年龄组呼吸道感染小儿九种病原体的检出率 [例（%）]
病原种类 新生儿（n=68） 婴儿组（n=410） 幼儿组（n=314）
儿童组（n=424）
总计 （n=1216）
2x 值
P 值 MP 5（7.0） 80（19.4） 109（34.7） 183（43.3） 377（31.0） 57.923 0.001 CP 0（0.0） 1（0.3） 12（3.8） 0（0.0） 13（0.2） RSV 4（5.3） 21（5.2） 15（4.9） 17（3.9） 57（4.7） ADV 0（0.0） 6（1.4） 6（1.9） 5（1.1） 17（1.4） IVA 0（0.0） 1（0.3） 0（0.0） 3（0.6） 4（0.3） IVB 4（5.3） 6（1.4） 13（4.2） 9（2.2） 32（2.6） PIV 0（0.0） 5（1.2） 14（4.5） 36（8.4） 55（4.5） CB 0（0.0） 0（0.0） 0（0.0） 0（0.0） 0（0.0） LP
0（0.0）
2（0.6） 20（6.4） 37（8.8） 59（4.8） 合计 8（12.3）
108（26.3）
140（44.5） 224（52.8）
72.189
0.001
病原种类春季
（n=305）
夏季
（n=331）
秋季
（n=248）
冬季
（n=332）
总计
（n=1216）
2
x值P值
MP 68（22.2）120（36.2）80（32.5）108（32.7）376（30.9）13.507 0.004 CT 0（0.0）0（0.0）2（1.0）0（0.0）2（0.2）
RSV 22（7.4）7（2.2）22（9.0）5（1.4）56（4.7）
ADV 9（3.1）0（0）5（1.9）2（0.7）16（1.4）
IV A 1（0.4）1（0.4）0（0.0）1（0.4）3（0.3）
IVB 11（3.5）1（0.4）8（3.3）12（3.6）32（2.6）
PIV 18（5.8）12（3.6）20（8.1）5（1.4）55（4.5）
CB 0（0.0）0（0.0）0（0.0）0（0.0）0（0.0）
LP 7（2.3）4（1.1）14（5.7）26（7.8）51（4.2）
混合感染32（10.5）11（3.2）26（10.5）31（9.3）100（8.2）
合计136（44.6）145（43.8）151（60.9）159（47.9）12.184 0.007 表2 呼吸道感染小儿九种病原体的季节分布 [例（%）]
标本（总量/人份）成人5074 儿童1216 项目数量阳性率% 数量阳性率% 嗜肺军团菌(LP) 162 3.19 16 1.32
肺炎支原体(MP) 603 11.88 222 18.26
Q热立克次体(COX) 19 0.37 4 0.33
肺炎衣原体(CP) 10 0.2 2 0.16
腺病毒(ADV) 16 0.32 4 0.33 呼吸道合胞病毒(RSV) 44 0.86 17 1.4
甲型流感病毒(IFA) 70 1.38 3 0.25
乙型流感病毒(IFB) 213 4.2 52 4.28
副流感病毒1、2和3型(PIVS) 87 1.71 8 0.66 总阳性率（%）1224 24.12 328 26.97
表3 呼吸道感染成人与儿童的对比情况 [例（%）]
4 结论
经过实验验证，以及对数据的整理汇总，在进行分析对比，发现儿童与成人之间的感染情况一致，皆是肺炎支原体（MP）与副型流感病毒（IVB）为感染的主流。

然后，儿童在幼儿与儿童组明显高于新生儿与婴儿组，且集中季节在秋冬季。

讨论
在长达一年的时间里，不仅仅是了解了病原题感染的情况，还在使用过程中了解到了操作方法与实验试剂的优缺点，并在这个过程中不断的调整，以适应需求。

在感染早期采集的样本可能检测不到IgG，在这种情况下建议采用IgM检测，或者在14-21天后采集第二个血清样本，并与原标本同时检测来确定是否发生血清转换。

对患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用本方法评价。

质控孔用于检测这种现象。

在嗜肺军团菌和Q热立克次体中，有时血清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。

当出现这种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了。

呼吸道感染病原除了常规易培养的细菌类病原微生物外，还有许多常规不易分离培养的病原微生物，它们生长周期长，培养阳性率低，影响了儿科对患儿的诊治，如MP，CP，RSV，ADV，IV A，IVB，PIV 1、2、3，COX，LP，等[5]。

因此对呼吸道感染小儿进行多种病原体分析，对临床诊断和治疗具有重要意义。

不同地区小儿呼吸道感染的病原谱不尽相同[6-11]，但这些研究都显示出MP和RSV 是小儿呼吸道感染的主要病原，本研究显示乌鲁木齐地区小儿呼吸道感染病原谱为MP> IVB > RSV>LP>PIV 1、2、3 > ADV=COX > IV A，MP检出率超过RSV居于首位。

MP 检出率随年龄增高而增高，在3岁以上儿童中检出率更是达到18.26%，这与国内其它地区报道基本一致[13.14]。

可见，MP为小儿呼吸道感染的主要病原体，尤其是3岁以上儿童。

本研究发现，病原体总检出率在季节间差异有统计学意义，秋冬季明显高于春夏季，这与国内其它地区报道基本一致[6-11]。

本次研究RSV检出率低于既往报道[11]，可能
为使用检测方法不同。

提示RSV荧光抗体检出的敏感性低于荧光免疫方法检测呼吸道分泌物中RSV抗原。

呼吸道感染是儿科常见的疾病，无条件地区常使用抗生素和抗病毒药物进行经验性治疗，往往达不到理想的治疗效果且造成抗生素的滥用，因此，除细菌外其它病原体的检测越来越受到重视。

本研究提示，随着小儿年龄的增长，以MP为代表的社区性病原体开始在大龄儿童中流行[13,14]，对呼吸道感染小儿进行MP普查，对于临床进行用药指导尤为重要，而现有的检测方法，如培养法和PCR法，由于其对环境、仪器、人员素质要求过高等原因，不适合于临床大量、快速的检测要求，因此，MP特异性IgM抗体检测是目前最适合于临床的检测方法，且对MP流行病学监测意义重大。

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重庆医科大学医学检验专业本科毕业论文开题报告
致谢
时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。

离校日期已日趋渐进，毕业论文的完成也随之进入了尾声。

从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师、同学、朋友给我热情的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意！在此我向重庆医科大学生物技术专业的所有老师表示衷心的感谢，谢谢你们三年的辛勤栽培，谢谢你们在教学的同时更多的是传授我们做人的道理，谢谢三年里面你们孜孜不倦的教诲！
三年寒窗，所收获的不仅仅是愈加丰厚的知识，更重要的是在阅读、实践中所培养的思维方式、表达能力和广阔视野。

很庆幸这三年来我遇到了如此多的良师益友，无论在学习上、生活上，还是工作上，都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在一个充满温馨的环境中度过三年的大学生活。

感恩之情难以用言语量度，谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意。

最后要感谢的是我的父母，他们不仅培养了我对中国传统文化的浓厚的兴趣，让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助。

在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望！我一定会好好孝敬他们，报答他们！爸妈，我爱你们！
“长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。

”这是我少年时最喜欢的诗句。

就用这话作为这篇论文的一个结尾，也是一段生活的结束。

希望自己能够继续少年时的梦想，永不放弃。

2015年6月4号。