呼吸道病原体检测

方法的局限性


对患有自身免疫性疾病病人的血清，用 IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、 呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细 胞上发生非特异性反应，这些血清不能 用此方法评价 质控孔用于检测这种现象
方法的局限性

在嗜肺军团菌和Q热立克次体中，有时血 清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使 用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。 当出现这种情况时，该血清就不能用IFA 进行分析了
乙型流感病毒

阴性：荧光弱、少
乙型流感病毒

阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个 视野的阳性细胞>3-5个
副流感病毒

阴性：荧光弱、少
副流感病毒

阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个 视野的阳性细胞>3-5个
方法的局限性


抗体水平无显著上升时不能排除感染的 可能性 单一样本抗体检测结果不能帮助作出近 期感染的诊断。应采集双份样本（急性 期和康复期）同时检测来观察血清转化 或抗体水平的明显升高

IgM IgG


机体产生IgM一般需要一周左右的时间， 而有免疫缺陷或免疫系统不健全的个体 如儿童，特别是3岁以下的小孩，其产生 抗体往往需要更久，且抗体产生的水平 也较低 若检测的是IgG，则不能很好地区分既往 感染和急性感染


因此，抗原检测的方法对婴幼儿和儿童 的呼吸道感染的病因诊断、鉴别诊断和 临床用药指导比抗体法更有优势 检测抗体IgM比IgG更有临床意义
呼吸道病原体检测
陆欢平
呼吸道感染


呼吸道感染是指病 原体感染人体的鼻 腔、咽喉、气管和 支气管等呼吸系统 分为上呼吸道感染 和下呼吸道感染
上呼吸道感染


常见急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或 喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见 的一种传染病 常见病因为病毒，少数由细菌引起。患 者不分年龄、性别、职业和地区。不仅 具有较强的传染性，而且可引起严重并 发症

采样对结果影响较大 非典型感染多为干咳，无痰/少痰 阳性率低（标本问题，病毒颗粒小） 抗原在体内存在时间短
九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测
检测原理

间接免疫荧光法（IFA ）是基于待测样本中的 抗体与吸附在载玻片上 的抗原发生的反应。样 本中存在的特异性抗体 和抗原反应，未与抗原 结合的免疫球蛋白在洗 涤步骤中除去。在下一 步骤中，抗原-抗体复合 物与荧光素标记的抗人 球蛋白反应，用免疫荧 光显微镜观察结果

支原体、衣原体感染导致的呼吸道感染 与其它病原体感染的早期临床表现类似 。可能在2-3天后咳嗽的症状会表现比较 突出。在小于30岁的年轻人中，肺炎支 原体是最重要的下呼吸道病原体
非典型呼吸道病原体

是指除肺炎链球菌以外的病原体，包括 嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP) 、肺 炎衣原体(CP) 、Q热立克次体(贝纳柯克 斯体) 、腺病毒(ADV) 、呼吸道合胞病毒 (RSV) 、流感病毒(IFV)和副流感病毒 (PIV)等

阳性：荧光密集，且亮度较好，杆状形 态
肺炎支原体

阴性：红色细胞周围无或少量荧光，亮 度弱
肺炎支原体

阳性：荧光占视野50%以上，亮度好， 形态为明显的细胞膜或胞浆
Q热立克次体

阴性：荧光弱、少、不规则
Q热立克次体

阳性：荧光亮度强且数量多，形态典型
肺炎衣原体

阴性：荧光弱、少
肺炎衣原体
呼吸道病原体

细菌：细菌引起呼吸道感染的机会比病 毒少。一旦感染，症状多较严重，定位 比较明显，如扁桃体炎、中耳炎、鼻窦 炎等。由细菌引起的儿童肺炎往往是流 感嗜血杆菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄 球菌
呼吸道病原体

病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合 胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病 毒等
呼吸道病原体
临床实际效果图
九联检
Leabharlann Baidu
思考题

质控孔的作用是什么？
检测最佳时间 一般在感染一周左右
病原体抗原检测
病毒感染出现症状后即可检测出
临床意义
回顾性诊断， 适用于疾病中后期的诊断，
可用于疾病早期诊断， 对患者的治疗有重要指导意义
检测灵敏度
将包被有不同基质的生物薄片固定在一个反应区中，可同时检测多种抗不同病 原体的抗体
检测方法
一般使用 ELISA或者间接免疫荧光法， 一般使用直接免疫荧光法，几乎没有 有非特异性荧光 非特异性反应，敏感性较差
实验步骤1


样本的稀释：血清标本与PBS按1:1比例 稀释 稀释后的血清加入吸附剂中，彻底混匀 。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉 淀，以防干扰检测
实验步骤2
结果判断
阴性结果荧光图谱

军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光； 支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、 呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈 现红色
非典型呼吸道病原体

这些病原体变异快，传播广，由于不易 形成长期免疫力而难以预防和控制
流感病毒
副流感病毒病毒 呼吸道合胞病毒
腺病毒
呼吸道病原体检测
现有的主要方法： 病毒分离培养 抗原检测 抗体检测 分子生物学方法等
检测方法的比较
检测方法 病毒分离培养 抗原检测 简便、快速、灵敏度和特异性均较高 需要特异性抗体、荧光显微镜， 优点 特异性高，金标准 缺点 培养条件要求高、灵敏度低，标
试剂盒组成
组分
载玻片 质控品 吸附剂 羊抗人IgG用来吸附人IgG避免干扰IgM 检测
成分和用途
检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并包被有针对 检测物的特异性抗原，
FITC结合 荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，和抗原抗 物 体复合物反应，并显色 封闭介质 甘油缓冲液，便于观察 磷酸盐缓 用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫 冲液(PBS) 球蛋白和结合物
本中病原体量少时，易致假阴性。
直接免疫荧光法
且可用于疾病的早期诊断
易受采样限制
抗体检测 间接免疫荧光法 酶联免疫吸附法 分子生物学方法 灵敏度、特异性较高 较快速，批量筛查 灵敏度和特异性均很高 对疾病早期诊断没有太大帮助 特异性不高，假阳性多 操作繁琐，价格昂贵
抗体、抗原检测的比较
抗体IgM检测
下呼吸道感染


包括急性气管/支气管炎、慢性支气管炎、 肺炎、支气管扩张等 由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团 菌等微生物引起，其防治应遵循预防为 主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗 时必须明确引起感染的病原体以选择有 效的抗生素
呼吸道病原体



常见的呼吸道病原体主要有病毒、细菌、 支原体、衣原体和立克次体等 据统计，90%以上急性呼吸道感染由病 毒引起 一种病原体可引起多种临床症状，同一 临床表现可由多种病原体引起
采样
抗原检测


拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向 鼻腔伸入。 伸入距离为从耳垂部到鼻尖长 度的一半，一般针对两周岁以下儿童，伸入 距离约为拭子绒毛头的长度两倍 拭子伸入后要轻轻捻动拭子转3圈。 取样后 在一小时之内洗脱到生理盐水中，12小时 内送检
抗原检测采样
采样
抗体检测
抗原检测的劣势
形态或荧光模式 杆状 细胞外围荧光模式
球杆状 球状 混合荧光模式（细胞核和胞浆或 胞膜） 混合荧光模式（细胞核和胞浆或 胞膜） 混合荧光模式（细胞核和胞浆或 胞膜） 混合荧光模式（细胞核和胞浆或 胞膜） 混合荧光模式（细胞核和胞浆或 胞膜）
副流感病毒
嗜肺军团菌

阴性：荧光弱、少、不规则
嗜肺军团菌

阳性：荧光密集，且亮度较好
腺病毒

阴性：荧光弱、少
腺病毒

阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个 视野的阳性细胞>3-5个
呼吸道合胞病毒

阴性：荧光弱、少
呼吸道合胞病毒

阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个 视野的阳性细胞>3-5个
甲型流感病毒

阴性：荧光弱、少
甲型流感病毒

阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个 视野的阳性细胞>3-5个
阳性结果荧光图谱

腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感 病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆 或胞膜出现苹果绿色荧光；军团菌、衣原体或 立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光； 支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧 光
病原体 嗜肺军团菌 肺炎支原体
立克次体 肺炎衣原体 腺病毒 呼吸道合胞病毒 甲型流感病毒 乙型流感病毒