实验一 氨基酸纸层析

组氨酸标准品。
wenku.baidu.com
(2)溶剂系统：
正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；
(3)显色剂：0.25%的茚三酮丙酮溶液。
2020/5/11
17
四、实验步骤：
1、样品的准备：
称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各 1mg混合溶于10%异丙醇中，0.01M。
2、滤纸的准备：
取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿 2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点 样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5 个点。
2020/5/11
4
层析的基本概念
二、定义
层析技术是根据被分离的混合物中各组分的理
化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两 相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定 相，称为流动相）中进行分配。
2020/5/11
5
层析的基本概念
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体 物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以 是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。
流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物 质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中 一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
2020/5/11
6
三、层析技术的种类
1、按流动相的状态分类：
（1）液相层析（色谱） （2）气相层析（色谱）；
2、按固定相的使用形式分类：
（1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析；
Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及 两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体
积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物
质分配系数不同，Rf也就不同。 （1）物质的结构和分子极性：
物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也
就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间
的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf
（7）样品溶液中杂质：
如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。
2020/5/11
16
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：
谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品
2、仪器：
(1)毛细管 (2)电热吹风机 (3)层析缸 (4)层析滤纸
(5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。
3、试剂：
(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、
流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在 滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。
由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以移
动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到 分离的目的。
2020/5/11
10
移动速率(比移值)：
原点到层析点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
2020/5/11
11
影响Rf值的主要因素：
一、发展史：
层析分离技术在20世纪初就已得到应用： ➢ 1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不
同的色带而被分开，由此得名为“色谱法” ➢ 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； ➢ 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； ➢ 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。
2020/5/11
18
2020/5/11
19
3、点样：
用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点四种 标准氨基酸；每个，每点一次用晾干后再点下次，点 样点的直径应控制在2mm左点样点重复点5次右，点 样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外。
Please be quiet, 上课了！！
2020/5/11
1
实验三
氨基酸纸层析
2020/5/11
学时：3
2
一、实验目的：
1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术；
2、掌握分配层析法； 3、掌握影响分配系数的因素。
2020/5/11
3
层析技术(chromatography 色谱技术)
2020/5/11
13
（4）滤纸：
层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁， 质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的 机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚 薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合 水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；
另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理 （可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）.
2020/5/11
14
（5）室验室的温度和时间:
温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影
响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层 析必须在恒温条件下进行。
2020/5/11
15
（6）展开方式：
上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的 液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易 扩散） Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸） 用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂 的流动，Rf较小。
2020/5/11
8
分配层析法：
利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的 分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系 数α是一个常数。
溶质在固定相的浓度(Cs)
分配系数α=
溶质在流动相的浓度（Cl)
2020/5/11
9
溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 因而其扩散作用降低形成固定相;
3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：
（1）吸附层析 （2）分配层析 （3）离子交换层析 （4）凝胶层析 （5）亲和层析等。
2020/5/11
7
二、实验原理:
纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。 滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相， 通常把有机溶剂作为流动相。 将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在 两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同， 不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些 氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点
小；反之,Rf则较大。
2020/5/11
12
（2）层析溶剂：
首先，溶剂的纯度要高。 其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf 在0.05～0.85。 再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸-水系统久放 易引起酯化。
（3）pH值： 溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物 质的极性和溶解度，使Rf改变；