共聚焦显微镜下的荧光观察

德国Leica激光扫描共聚焦显微镜
• 1、取一瓶生长状态良好的细胞，将细胞消化悬浮后，接种到共聚焦培养皿中。 • 2、12h后待其贴壁70%-80%后，转染相应质粒。 • 3、24-48h 后，PBS洗三遍。 • 4、用4%多聚甲醛对细胞进行固定， 20min。 • 5、PBS洗三次后，用0.3%TritonX-100 PBS对细胞打孔，冰上孵育10min。 • 6、PBS洗三次后，孵育一抗，4℃过夜。 • 7、PBS洗三次后，孵育荧光二抗，2小时。 • 8、PBS洗三次后，4%多聚甲醛固定20min. • 9、PBS洗三次后，DAPI染核15min。 • 10、PBS洗三次后，共聚焦显微镜观察。
共聚焦显微镜下的荧光观察
荧光的基本知识
• 一、荧光 • 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给， 发光亦瞬间停止。荧光蛋白是一种可吸收激发光的光便能产生荧光的蛋白。
• 发射光谱指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。
• 激发光谱指国定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的 荧光发射强度。
共聚焦显微镜应用技术
• 1、免疫荧光技术 • • 用荧光标记的抗体或抗原与样品中相应的抗原或抗体结合，以适当检测 荧光的技术对其进行分析的方法。 由于荧光素所发出的荧光可在共聚焦显微镜下检出，从而可对抗原进行 细胞定位。
DAPI
AlexFluor598-IRF3
mer源自文库e
• 2、自发荧光的生物大分子 • 绿色荧光蛋白
•
绿色荧光蛋白（ GFP ），其基因产生的蛋白质，在蓝色波长范围的
光线激发下，会发出绿色荧光。
• 应用：利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP 作为蛋白质标签，即利用 DNA重组技术，将目的基因与 GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞 进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白进行细胞内活体观察
免疫荧光操作步骤