免疫组化实验方法

③ 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对 比鲜明，能清晰判断结果。 ④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质 和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合物应无毒，附加抗原性小。
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常用的染色方法
• 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫 酶标法，亲和组织化学法
• 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则 可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接 法（一步法）、间接法（二步法）、桥连 法等。每进行一步结合反应。都会产生一 次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低 依次为桥连法、间接法、直接法。
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免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）
• 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂 片）。
• 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连 续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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细胞和组织的固定
1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶 活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非 水溶性抗原，防止抗原弥散。
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酶标抗体法
• 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体， 再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的 不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面 或内部某种抗原成分定位观察。 • 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷 酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。 • 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通 光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理 后，电子密度增强，可用于电镜观察。
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抗生物素-生物素-过氧化物酶技术 (avidin-biotin peroxidase complex ABC)
• 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生 物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标 记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化 物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与 过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：
3. 正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商 提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。
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设立阳性对照和阴性对照
----证明实验系统的正确性
1. 阳性对照：主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和
检测系统等因素。尤其在结果出现无信号时，为查找 原因提供重要线索。 2. 阴性对照：一种是自身对照（常用），指测试组织 本身非抗原表达部位。一种是外部对照，指已证实不 表达检测抗原的组织。
•可用于双重或多重免疫染色。
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免疫金染色原理：
免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后
在光学显微镜下检测抗原。
解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。
整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预
先处理样本以消除内源性酶的活性。
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免疫组化试剂的正确选择和使用
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一抗
1. 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和 力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非 特异性结合，减少染色背景。 2. 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过， 尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭 液（可以是BSA或二抗来源的正常动物血清）充分封 闭，以阻断非特异性结合位点。 3. 跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子 或是胞外区、胞内区。对于胞内区抗体，染色时需要 使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。 4. 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。 但常常需要重新选择比例。一般从供应商提供稀释比 例的1/10稀释度始，作倍比稀释。
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荧光素
1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）黄色、 橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～495 nm， 最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 最常用。 2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光 谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明。 3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐红 色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～ 600nm，呈橙红色荧光。价廉。
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免疫组化实验方法
免疫组织化学的概念
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过
化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、
酶、金属离子、同位素）显色来确定组织
细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行
定位、定性及定量的研究，称为免疫组织
化学。
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最突出的优点
• 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢 结合起来，在微观世界原位地确定组织及 细胞结构的化学成分，达到方法统一，定 性可靠，定位准确，定量可能。
• ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广 • ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低
• ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性 HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合 进行双染
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ABC法的特点： •敏感性强 •特异性强，背景染色淡 •方法简便，节约时间
2．选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。
（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中 性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。 （3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
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染色注意事项
（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。 （2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右） （3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定 存档标本要求组织结构完好。 （4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。 （5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。 （6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
3．常用的固定方法-பைடு நூலகம்浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够（>20倍）
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抗体
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
特性比较：
1. 均一性
2. 稳定性
3. 特异性
4. 重复性 5. 沉淀反应
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荧光素标记抗体
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为 荧光色素。必备条件:
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试剂保存------抗体试剂保存：
•抗体浓度越高越稳定，易保存；浓度低时，应加 0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加 0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。 •酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否 则会抑制酶的活性。 •抗体浓缩液应在-20℃保存，可以长达两年；用时取 出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量 分装，-20℃保存，避免反复冻融；融解后抗体于2－ 8℃可以保存一个月。
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二抗
1. 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说， 如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种 属抗小鼠的抗体。 2. 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后， 可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二 抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以选用山羊抗小鼠的Ig或
IgG1的二抗。
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染色的基本程序
①标记抗体与标本中抗原反应结合；
②用缓冲液洗去未结合的成分；
③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。
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反应条件
抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件： （1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成 （2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成 （3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20， EDTA（0.01%），Triton X-100（0.1～1%） （4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的 非特异吸附，常用牛血清白蛋白 （5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入 适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应， 低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。 选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇