中国药典2020版鲎试剂细菌内毒素检查凝胶半定量试验SOP

1目的

建立细菌内毒素凝胶半定量试验操作规程，以指导检验人员的正确规范操作。

2适用范围

适用于细菌内毒素检查法中的凝胶半定量试验。

本规程参照《中国药典》2020年版四部-1143细菌内毒素检查法制定。

3职责

进行细菌内毒素检查的操作人员严格按本规程进行操作。

4内容

4.1基本原理与术语

4.1.1本法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。本试验操作过程应防止内毒素

的污染。

4.1.2鲎试剂灵敏度复核试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的

改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

4.1.3干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项目的品种建立内毒素检查法

时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有

可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

4.1.4EU：内毒素单位，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

4.1.5λ：鲎试剂的标示灵敏度，单位：EU/ml。

4.1.6MVD：最大有效稀释倍数，指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数。

4.2材料准备

4.2.1细菌内毒素工作标准品：应经细菌内毒素国家标准品为基准标定效价；

4.2.2鲎试剂：已按《细菌内毒素预试验SOP》进行鲎试剂灵敏度复核试验；

4.2.3细菌内毒素检查用水（BET水）：内毒素含量应＜0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用；

4.2.4供试品溶液：pH宜在6.0~8.0范围内，否则用已去除内毒素和干扰因子的酸、碱溶液或缓

冲液调节。

4.3器具准备

4.3.1移液枪、一次性除热源枪头（1000μL、200μL）；

4.3.2剪刀、砂轮片、试管架、除热源试管、医用胶布；

4.3.3恒温培养箱（37℃±1℃）、旋涡混合器、洁净工作台。

4.4供试品溶液的要求

4.4.1将供试品的原液用BET水按已通过干扰试验的稀释倍数稀释，即得。

4.5试验溶液的制备

4.5.1根据当批鲎试剂的标示灵敏度（λ），把细菌内毒素工作标准品用适量BET水溶解，在旋涡

混合器上混匀15分钟。

4.5.2【A组】：将供试品溶液用BET水以原倍、1:2、1:4、1:8倍比稀释（最后的稀释倍数不得超

过MVD），各浓度平行制备2管，共8管。

4.5.3【B组】（PPC，供试品阳性对照）：将细菌内毒素工作标准品用供试品溶液配制成2λ浓度，

平行制备2管。

注意：工作标准品稀释过程中，每步稀释应不超过10倍，每稀释一步应在混合器上均匀至

少30秒。

4.5.4【C组】（鲎试剂标示灵敏度的对照）：将细菌内毒素工作标准品用BET水配制成2λ浓度，

再以1:2、1:4、1:8倍比稀释（即配制成1λ、0.5λ、0.25λ的浓度），各浓度平行制备2

管，共8管。

4.5.5【D组】（NC，阴性对照）：以BET水作为阴性对照，共2管。

4.6试验过程

4.6.1取20支鲎试剂，按A、B、C、D组别（如图1）排列标注好，每支加入0.1ml BET水。

图1 凝胶半定量试验

4.6.2然后把各组别的试验溶液加入管中，每支加入0.1ml，按浓度高至低依次加入。

4.6.3将上述试管溶液轻轻混匀后，用医用胶布封口，垂直放入恒温培养箱（37℃±1℃）中，孵

育60±2分钟。

4.6.4孵育结束后将试管轻轻取出，缓缓倒转180°。

4.6.5若管内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落，为阳性；若未形成凝胶，或形成凝胶后变形、从

管壁滑落者，为阴性。

注意：拿取试管过程中应避免震动而造成假阴性结果。

4.7计算C组的反应终点浓度的几何平均值

4.7.1当最大浓度2λ的平行管均为阳性，最低浓度0.25λ的平行管均为阴性时，试验有效。

4.7.2试验有效的情况下，按式（1）计算反应终点浓度的几何平均值：

λc=antilg(Σx/4)

——式（1）

4.7.3注：公式的计算说明，见《细菌内毒素预试验SOP》。

4.8结果判定

4.8.1若【D组】平行管均为阴性，【B组】平行管均为阳性，【C组】反应终点浓度的几何平均值

在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ），试验有效。

4.8.2【A组】中，每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度。若检验

的供试品是经稀释后的，则将反应终点浓度乘以初始稀释倍数，即得每一系列内毒素浓度（c）。

4.8.3当【A组】每一系列的内毒素浓度（c）均小于规定的内毒素限值（L）时，判定供试品符合

要求。

•按式（2

——式（2）•若所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ；若检验的供试品是经稀释后的，则记为小于λ乘以初始稀释倍数。

4.8.4当【A组】任何系列内毒素浓度（c）不小于规定的限值（L）时，则判定供试品不符合规定。

•若所有平行管均为阳性，可记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

5相关文件

5.1《中国药典》2015年版四部-1143细菌内毒素检查法

5.2《细菌内毒素预试验SOP》

6记录

《细菌内毒素检验记录》