《植物组织培养》课件第3章植物组织培养技术-灭菌方法、无菌操作技术

3.选取适宜的大小 ：一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm
材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织， 甚至难于成活
外植体（叶）的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同 胶皮枫香树（Liquidamnbar styraciflua “Variegata”）叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响
第三章 植物组织培养技术---灭 菌方法、无菌操作技术
内容：
灭菌 无菌操作 愈伤组织的分化与再分化、脱分化 形态发生
教学目的要求
1．掌握外植体的选择条件与消毒方法； 2．掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件； 3．了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形 成过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组 织的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组 织培养的基础技术。 4．一般掌握离体叶片和离体根培养基本过 程（选修）；掌握离体茎培养的种类和操作 步骤；
包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料。 2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对 流和穿透； 4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱， 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
4.过滤灭菌（不耐热的物质 ）
消毒：
指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不 再发生危害作用的过程。
（二）常用的灭菌与消毒方法
灭菌方法：
物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、 微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等灭 菌措施； 化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效 果。
注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底。
2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ）
镊子、剪子、解剖刀等： →浸入95%的酒精中 →酒精灯火焰上灼烧灭菌 →冷却后，立即使用。
3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） ——利用烘箱加热到160-180°C的温度（持续 90min）来杀死微生物。 注意： 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为
（一）有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，
它的表面都是有菌的。
无菌的范畴：
经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体wk.baidu.com经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。
菌类： 细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。 茵的特点：
☆极小，肉眼看不见； ☆无处不有，适应能力强； ☆繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
(2)熏蒸灭菌
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气 和物体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。 常用方法：房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将 甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸 时，房间可预先喷湿以加强效果。
6.喷雾灭菌（物体表面） 70%～75%的酒精 l%-2%的来苏儿溶液 0.25%—1%的新洁尔灭 涂擦、喷雾
每个外植体形成不定芽分生组织的数目 外植体 部位 由培养基上增 殖苗中的叶片 由温室生长2年的完 整植株上的叶片
叶 柄 叶 片 总 数
6.7 8.0 14.7
6.7 50.3 57.0
外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中，实验用外 植体数为70
二、灭菌与消毒
本节教学重点、难点：
重点：无菌操作技术；组培苗的培养 难点：无菌操作技术
第一节 外植体的选择和消毒
一、外植体的选择
选取性状优良的种质或特殊的基因型
1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫 、发育正常
代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功
2.选择最适的时期 ：旺盛生长期
注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶 生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多， 不易消毒而难以培养成功。
1.湿热灭菌（培养基）
高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外
溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在 此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽 孢。
常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到
O．05MPa时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力 表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上 升达到0．1MPa开始计时，压力0．1---0．15MPa，20min。
抗菌素 4~50mg/ L
30~60
中
较好
第三步.无菌水涮洗
——是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
☆灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可； ☆升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗6～10次。
（桌面、墙面、双手、植物材料表面等）
7.植物材料表面用消毒剂灭菌√
第一步：
1、将采来的植物材料除去不用的部分，仔细 洗干净。 2、切割成适当大小（即灭菌容器能放人为 宜）。 3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时 （可加入 洗衣粉）。
第二步：是对材料的表面浸润灭菌。
1.准备工作：
准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%～75%酒精、 消毒液、无菌水、手表等。
2.酒精浸润消毒：
用70%酒精浸10～30s。70%酒精穿透力强，也 很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。
3. 化学灭菌剂处理
消毒剂消毒原理： 利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 使用浓度 持续时间 去除的难 (%) 灭菌剂 （min） 易 次氯酸 钙 次氯酸 钠 氯化汞 9~10 2 0.1~1 5~30 5~30 5~8 易 易 较难 效果 很好 很好 最好
对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的
制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素、 玉米素、脱落酸和某些维生素等。 滤膜网孔直径：0.45μm以下，当溶液通 过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。
5.紫外线和熏蒸灭菌（空间）
(1)紫外线灭菌
紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌 能力最强，要求距照射物以不超过1.2m为宜。