-肝糖原的提取、鉴定与定量

生物化学实验报告

姓名：范嘉俊

学号： **********

专业年级： 2014级中西医临床五年制组别：第四实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

1.实验原理

（1）肝糖原提取与鉴定

①提取：

1.糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，释放出糖原。

2. 5%三氯醋酸溶液能使用糖原与蛋白质分离，糖原保存于上清液，而蛋白质沉淀。

3.糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

②鉴定：

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。糖原还可被酸水解为葡萄糖。利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

（2）肝糖原定量测定

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糖醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在(10~100)mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。

（1）实验样品：鸡肝。

（2）主要试剂：

肝糖原的提取与鉴定：95%乙醇，0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液，

0.15mol/LNaCl溶液，

浓盐酸，NaOH溶液，

碘试剂。

肝糖原定量测定：30%KOH溶液，0.5mg/ml的葡萄糖溶液，

蒸馏水，蒽酮显色剂。

（3）主要仪器与器材：可见光分光光度计，

恒温水浴箱，

试管架，三支支试管，

加样枪，加样枪架，

普通离心机，

研钵，

刻度吸量管，

白瓷反应器，

100ml容量瓶。

3.实验步骤

（1）实验流程

①肝糖原的提取与鉴定

注意事项：

①在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混匀（可以用玻璃棒搅拌）。

②糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基的多少有关。肝糖原分支中葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。

③糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。

②肝糖原的定量测定

步骤操作

糖原提取在试管中加入30%KOH1.5ml，在称取0.10～0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。取出后冷却，将管内容物全部移入100ml

容量瓶，定容，摇匀。

糖原的测定取3支试管，按下表操作：

试剂（ml）空白管标准管样品管

蒸馏水 1.0 - -

标准葡萄糖溶液- 1.0 -

糖原提取液- - 1.0

0.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5

混匀，沸水浴10min，冷却。在分光光度计620nm波长处，用空白

光溶液调零，测定个溶液的吸光光度（A）。

计算出样品肝糖原含量。

注意事项：

①肝组织必须在沸水浴中完全溶解，否则影响比色。

②注意要全部溶液，用水多次洗试管，一并收入容量瓶中。

③蒽酮溶液必须2倍于被测液。

④若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原。

4.实验记录

实验中观察到的现象

（1）糖原的提取与鉴定

①鸡肝上清液经乙醇处理，离心后得到微量的白色沉淀物。

上清液

沉淀

②糖原溶解液滴加碘液后，对比纯碘液，有红棕色物质生成。

红棕色物质纯碘液

③用班氏试剂与糖原水解液反应，混匀后沸水浴2min ，发现管壁有砖红色沉淀。

反应前 反应后

（2）肝糖原定量测定

加蒽酮试剂的糖原溶液（水浴后）：

可见：空白管中为浅黄色；标准管中为蓝绿色；样品管中为浅绿色。 3.原始实验数据： 620nm 波长吸光值记录表

测定次数

各管吸光值（A620） 空白管

标准管 样品管 1

0.654

0.098

空白管

标准管 样品管

2 0 0.654 0.098

3 0 0.653 0.098

各管平均值A—620 0 0.6537 0.098

5.结果与讨论：

1.结果

①由碘液反应结果可知，鸡肝中存在少含量的肝糖原。

②肝糖原含量计算：根据如下公式：

肝糖原（g/100g肝组织）=A样本/A标准⨯0.05⨯(100/肝组织重) ⨯0.1⨯1.11

计算得本组肝糖原含量为0.554g/100g肝组织。

2.讨论

（1）肝糖原的提取与鉴定实验：第二次离心后的糖原溶液白色沉淀明显；加碘试剂与糖原试剂混合有红棕色沉淀，鉴定出糖原；实验结果与预期基本吻合，实验基本成功（2）肝糖原的定量测定实验：通常，每百克鸡肝组织中肝糖原含量在2-3克之间。本实验中测得肝糖原数值（0.554g/100g肝组织，即0.554%）偏低于标准范围值，这可能是由于沸水浴后冷却后转移液体的时候部分液体残留在试管未完全转移或者转移时部分液体流失导致肝糖原损失，进而导致实验数据出现失误。