无菌检测操作规程

无菌检测作业指导书

1目的

规范公司产品的无菌检测的工作流程和内容。

2 适用范围

生化实验室内的无菌室。

3职责

生化实验室：无菌检验专员：负责公司产品的无菌检测。

4 定义

4.1 成品：环氧乙烷（EOG）灭菌后的产品。

4.2 灭菌批：成品环氧乙烷（EOG）灭菌的批次。

5 工作流程图

实验前准备——实验——实验后整理

6 程序内容

6.1 检测环境的要求

洁净度10000级以下局部100级的超净工作台单向流空气环境下，并且环境洁净度检验合格。

6.2培养基和稀释液、冲洗液的制备

6.2.1培养基的制备：

依照《中国药典》2010版第二部“无菌检查法”中“培养基”一栏中的方法准备，见附页1。

6.2.2提取液，冲洗液的制备：

依照《中国药典》2010版第二部“无菌检查法”中“稀释液、冲洗液及其制备方法”一栏中的方法准备，见附页1。

6.3 无菌检查方法的验证

在第一次进行试验或者检验因素发生变化时，应依照《中国药典》2010版第二部“无菌检查法”中“方法验证试验”一栏中的方法进行，见附页2。

6.4 产品的检验

6.4.1 检验对象：环氧乙烷（EOG）灭菌后的成品

6.4.2 检验频次：按灭菌批次进行无菌检验。

6.4.3 抽检数量：

产品≤100件， 10%或4件（取较大者）

100件<产品≤500， 10件

产品>500件， 2%或20件（取较小者）

6.4.4 检验方法：

具体方法依照《中国药典》2010版第二部“无菌检查法”中“供试品的无菌检查”一栏中的方法进行，采用薄膜过滤法，做阴性、阳性对照试验，培养

14天，祥见附页2。

6.5结果判定：

依照《中国药典》2010版第二部“无菌检查法”中“结果判断”一栏中的方法进行，见附页2。

一、培养基的制备

1. 硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养好氧菌、厌气菌)

酪胨（胰酶水解）15g

氯化钠 2.5g

葡萄糖5g

新配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml

L-胱氨酸0.5g (或新配制的0.2％亚甲蓝溶液0.5ml) 硫乙醇酸钠0.5g (或硫乙醇酸0.3ml)

琼脂0.75g

水1000ml

酵母浸出粉5g

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前, 培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则,须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却, 只限加热一次，并应防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃培养。

2. 改良马丁培养基（用于培养真菌）

胨5g

磷酸氢二钾1g

酵母浸出粉2g

硫酸镁0.5g

葡萄糖20g

水1000ml

除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸,加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。

改良马丁培养基置23~28℃培养。

二、提取液、冲洗液的制备

1. PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23 g 、氯化钠4.30g 、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

2. 0.9%氯化钠溶液取氯化钠9g，加水1000ml，溶解，分装，灭菌。

一、培养基的适用性检查

1.无菌性检查取灭菌后的两种培养基各5支，按规定温度培养14天，均应无菌生长

2.灵敏度检查

2.1.所需菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]

枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(B) 64 941]

白色念珠菌[CMCC（F）98001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003]

2.2菌液制备

2.2.1 将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，35 ℃培养24小时，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。

2.2.2 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，35℃培养24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。

2.2.3 将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，24℃培养48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。

2.2.4 将黑曲霉菌的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，24℃培养5天，加入5毫升0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10毫升吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数50-100cfu 的孢子悬液。

2.3 培养基接种

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种确定好稀释级的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种确定好稀释级的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。

2.4 结果判断

空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

二、方法认证

1.所需菌种

大肠埃希菌[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(B) 64 941]

白色念珠菌[CMCC（F）98001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003]

2.菌液制备

2.1 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至营养肉汤培养基中，35 ℃培养24小时，分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。

2.2 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，35℃培养24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。

2.3 将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，24℃培养48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50-100cfu的菌液。

2.4 将黑曲霉菌的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，24℃培养5天，加入5毫升0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10毫升吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数50-100cfu