结核感染T细胞T-SPOTTB检测项目酶联免疫斑点技术
T-SPOT_TB操作说明电子版
结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
T细胞酶联免疫斑点试验在结核病诊断中的应用
T细胞酶联免疫斑点试验在结核病诊断中的应用目的：探讨结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速诊断的临床应用价值。
方法：选取74例结核病患者（疾病组）和48例非结核病（对照组）对照，同时采用结核杆菌涂片、结核抗体（TB-Ab）、结核菌素试验（TB-PPD）及结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）进行检测，并比较四种检测方法对结核病的诊断价值。
结果：T-SPOT.TB法的敏感性为75.68%、特异性为91.67%、阳性预测值为93.33%、阴性预测值为70.97%，均明显高于TB-PPD法的55.41%、56.25%、66.13%、45.00%和TB-Ab法的36.49%、68.75%、64.29%、41.25%，涂片染色镜检阳性率仅为9.46%。
结论：T-SPOT.TB 是诊断结核感染的快速、敏感的方法，在结核性疾病早期诊断中有重要价值。
标签：结核杆菌涂片；结核抗体；结核菌素试验；T细胞酶联免疫斑点试验；结核病我国是全球结核高疫情国家之一，年新发病例超过100万人，以肺结核为主，肺外结核约占15%～20%[1]。
目前结核病的诊断主要依靠临床症状、影像学、痰涂片、痰分枝杆菌培养和结核菌素（PPD）试验等，阳性率与特异性均较低，临床上易造成漏诊和误诊，肺外结核更为明显，结核分枝杆菌培养阳性是结核诊断的金标准，但分枝杆菌培养时间太长（6～8周）[2]。
江苏省已广泛接种卡介苗（BCG），与结核菌素试验所用的结核杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）有交叉反应，会出现较高的假阳性，部分老年人或免疫功能低下患者又会出现较高的假阴性率，影响患者的诊断和治疗。
因此笔者所在医院引进近年发展起来的结核感染T 细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB），为临床早期发现结核病提供帮助。
本文采用回顾性分析的方法，探讨结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病快速诊断的临床应用价值。
T-SPOT.TB
优势
• 该检测方法采用的结核杆菌特异性抗原为ESAT-6和CFP-10，其编 码基因RD1在BCG（卡介苗）和绝大多数非结核杆菌中是缺失的， 因此较好的避免了交叉抗原反应，提高了特异性。
原理
1.从全血中分离出外周血单个核细胞PBMCs 2.将样本加入反应孔，每个样本需要4个检 测孔：
①空白对照为了判断非特异细胞的活化反应 ②结核特异抗原A，Panel A(ESAT-6) ③结核特异抗原B，Panel B(CFP 10) ④植物血凝素PHA对照，用于判断PBMC活性
结果
前提：通常正常结果，空白对照孔没有或 有很少的斑点而植物血凝素PHA对照孔斑 点数超过20个。 1.阳性结果：
①空白对照孔斑点数为0～5个且（抗原A或抗原B斑点 数)-（空白对照孔斑点数）≥6 ②空白对照孔斑点数6-10个时且（抗原A或抗原B斑点 数）≥2倍空白对照孔斑点数
2.阴性结果：
不符合上述标准且对照孔正常
• 3.虽然ESAT-6和CFP10在所有的BCG菌株， 以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但TSPOT.TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、 戈登或海分枝杆菌的感染引起的。
临床应用
传染科/感染科： 1.2-3周以上的不明原因发热病人的结核感 染排筛 2.免疫力低下患者肺外结核的辅助诊断 卡介苗接种人群的结核感染筛查 3.HIV感染者并发结核的筛查 T-SPOT.TB不受CD4细胞计数水平的影响， 避免了HIV感染后细胞免疫功能受损而导致 的假阴性结果。
T-SPOT.TB
关于原理与临床应用的ຫໍສະໝຸດ 述• T: T细胞 • SPOT：ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay；酶联免疫斑点 技术)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学 新技术。原理是用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联 斑点显色的方式将其表现出来。 • TB：结核杆菌
结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在HIV合并肺结核人群中的诊断性能研究
根 据 临 床 表 现 （发 热 、咳 嗽 、胸 痛 、呼 吸 困 难 等 ）、 影 像 学 表 现 ( 斑 片 、结 节 、纵 隔 淋 巴 结 肿 大 等 ）以及病 原 学 检 测 结 果 ，病 原 学 检 测 方 法 包 括 痰 涂 片 、痰培 养 、分 子 生 物 学 检 测 ，其中 任意 一项结果阳性定义为
2. 2 T-SPOT.T B 与分子生物学检测结果比较分析 进 行 分 子 生 物 学 检 测 的 样 本 包 含 4 2 例 Gene-
Xpert检 测 样 本 以 及 5 6 例 L A M P 检 测 样 本 ，共计 98 例 .其 按 照 临 床 诊 断 结 果 分 为 肺 结 核 组 44 例.肺 部 其 它 疾 病 组 5 4 例 ，将 其 与 T-SPOT. T B 的结果进 行 比 较 显 示 ：T-SPOT. T B 检 测 的 敏 感 性 77. 2 7 % ( 3 4 / 4 4 ) 高 于 分 子 生 物 学 检 测 敏 感 性 47. 7 3 % ( 2 1 /
195例 确 诊 或 临 床 诊 断 为 H IV 阳性合并肺结 核 的 患 者 中 ，T -S PO T .T B 检 测 阳 性 1 4 3 例 ，敏感性 为 73. 3 3 % ; 3 1 7 例 H I V 阳 性 肺 部 其 它 疾 病 患 者 中 ， T -SPOT.T B 检 测 阴 性 2 7 5 例 ，特 异 性 为 86. 7 5 % 。 见 表 1。
表 1 H I V 合 并 结 核 病 患 者 T-SPOT. T B 检测结果
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析一、酶联免疫斑点检测技术简介酶联免疫斑点检测技术是一种用于检测蛋白质激活的新型生物物理化学技术，该技术利用酶标记的抗体与细胞分泌的干扰素γ（IFN-γ）结合，通过酶作用将显色底物作用聚积在细胞分泌的蛋白质的位置，形成斑点。
通过计数斑点的数量，可以间接反映出细胞分泌的干扰素γ的水平，从而分析细胞免疫功能。
酶联免疫斑点检测技术具有灵敏度高、准确性好、操作简单快捷等优点，已被广泛应用于病毒性感染、肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病等领域。
二、酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中的应用1. IFN-γ的检测IFN-γ是由T细胞和自然杀伤细胞分泌的一种细胞因子，其在机体的抗结核感染和免疫过程中起着非常重要的作用。
结核分枝杆菌感染后，机体会产生大量的IFN-γ，通过检测IFN-γ水平可以判断机体是否感染结核分枝杆菌。
酶联免疫斑点检测技术正是通过检测IFN-γ水平来诊断结核病的一种重要方法。
应用该技术，可以在脑脊液中检测到IFN-γ水平的变化，从而辅助结核性脑膜炎的诊断。
2. 结核分枝杆菌特异性抗原的检测酶联免疫斑点检测技术可以利用结核分枝杆菌特异性抗原来刺激患者的T细胞，进而检测其分泌的IFN-γ水平。
该方法的优势在于可以用特异性的抗原刺激T细胞，从而提高检测的特异性。
结核分枝杆菌特异性抗原包括早期分泌抗原（ESAT-6、Cfp10）和Ag85等，这些抗原可以刺激机体产生特异性的免疫应答，因此可以作为诊断结核性脑膜炎的生物标志物。
三、酶联免疫斑点检测技术的挑战与展望尽管酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中表现出了良好的应用前景，但仍然面临着一些挑战。
酶联免疫斑点检测技术在操作上需要高度的专业技能，对实验人员的要求较高。
目前酶联免疫斑点检测技术的商业化产品尚未完善，需要更多的临床验证和实际应用。
结核分枝杆菌的种类和亚型繁多，不同地区和不同个体对结核分枝杆菌的免疫应答也存在差异，因此需要针对性地选择合适的抗原进行检测，从而提高诊断的特异性和准确性。
T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)
4．用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂。
4．不能用含有Tween或其它去污成分的PBS缓冲液，
这会导致高的本底结果。确保标记抗体工作液有少
量剩余（考虑到耗损）。因而，对于8孔板条（每孔
需要50ul），配制500ul标记抗体工作液，取2.5ul的
浓缩标记抗体试剂加497.5ul的PBS缓冲液
5．每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵 5．不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
3.每吸取100ul细胞终溶液前都必须保证彻底混匀。 推荐每孔加样后都更换新的枪头以避免4个反应孔 出现交叉污染。 4. 为避免干扰，培养板应立即放入孵育箱。不要把 培养板堆叠，会导致温度的不均匀和空气的不流通。 不按照推荐的时间孵育会导致不正确的检测结果。
2.斑点记数
在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹
注意：细胞培养液使用前需预温至 37℃
步骤 1.依照说明书的要求采集全血样本。室温保存 （18-25℃），不能冷冻或冷藏 2.对于使用CPT采血管的，根据厂家说明书要求来分 离PBMCs。 对于其它方法采集血样的，利用Ficoll-PaqueTMPlus 按照操作说明分离PBMCs
3.用吸液管吸取白色、云雾状PBMCs层并转移至15ml 尖底离心管中。加入细胞培养液至10ml。 4.600g离心7分钟。弃去上清液用1ml培养液重悬沉 淀。 5.加培养液至10ml，350g离心7分钟。 6.弃去上清液加0.7ml培养液重悬沉淀。
痕会导致斑点假象，影响斑点记数。
步骤
注意点
1．从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液。
1．此时从试剂盒取出底物显色溶液恢复至室温。
T细胞酶联免疫斑点法诊断结核性脑膜炎的Meta分析的开题报告
T细胞酶联免疫斑点法诊断结核性脑膜炎的Meta分
析的开题报告
一、研究背景
结核性脑膜炎是结核病的严重并发症之一，常常导致死亡或严重残疾。
传统的诊断方法往往存在局限性，比如对病原体的特异性和敏感性不高，导致误诊率较高。
近年来，T细胞酶联免疫斑点法（T-Spot.TB）作为一种新型的结核病诊断方法引起了广泛关注。
T-Spot.TB与传统的结核诊断方法相比有更高的特异性和敏感性，但其在结核性脑膜炎的应用价值目前尚未确定。
二、研究目的
本研究旨在通过Meta分析研究T-Spot.TB在结核性脑膜炎诊断中的应用价值，以提供一定的参考和指导，为医生临床上更准确地诊断和治疗结核性脑膜炎提供支持。
三、研究方法
1. 检索文献：在PubMed、Embase、Cochrane Library等数据库中检索相关文献，同时手动检索近年来的相关文章。
2. 选择研究：选择符合纳入标准的原始文献，排除重复和不符合要求的文献，最终确定入选的文献。
3. 数据提取：从入选的文献中提取出T-Spot.TB在结核性脑膜炎诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值等数据，并进行质量评估。
4. 统计分析：采用Meta-DiSc 1.4软件分析所选结果的汇总效应量和统计学差异并进行灵敏度分析和亚组分析。
四、预期结果
通过本文献综述和Meta分析的研究，预期得到以下结果：
1. T-Spot.TB在结核性脑膜炎诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值的定量结果。
2. 确定T-Spot.TB在结核性脑膜炎诊断中的应用价值和局限性。
3. 提出相应的结论和建议，为医生临床上更准确地诊断和治疗结核性脑膜炎提供支持。
结核感染T细胞(T-SPOT.TB)
结核感染T细胞（T-SPOT.TB）一、名称结核感染T细胞（T-SPOT.TB）二、项目简介、临床意义及收费标准T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，其灵敏高于ELISA方法。
该检测通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。
该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况，其诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
收费标准：740元/人份，收费依据：混合淋巴细胞培养（W0309050020）（250元）×2次；干扰素测定（W0309060008）（120元）×2种抗原。
三、标本采取1.静脉血：肝素锂（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
2.脑脊液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀。
3.浆膜腔积液（胸水、腹水、心包积液）：无菌密闭容器留取50ml以上，每100毫升加2500IU（0.4ml）抗凝并立即混匀。
4.关节液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀。
四、检测时间、报告时间检测时间：每周二（节假日除外）进行检测，标本必须在上午9点前送达实验室。
报告时间：周三出报告。
五、注意事项1.标本采集后4小时内必须送到实验室进行检测，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
2.检测脑脊液、浆膜腔积液、关节液，须同时送检静脉血。
3.冬季运送标本时注意保温，避免冷冻。
六、联系科室和电话检验科微生物室(TeL：84205491)。
T+SPOT+TB技术用于结核的辅助诊断
邀生塑当壁銎！ＱＱ§生！旦箜！鲞筮３翅』！！塑尘堕丛ｉ！！垡墅！趔！！照ｉ塑：垃塑！鲢１２Ｑ堕：坠！！：盟！：３肌力３级，肌张力可，余肢体肌力，肌张力正常。
脑脊液检查：白细胞２×１０６／Ｌ，总蛋白９８３ｍｇ／Ｌ，葡萄糖３．９ｍｍｏｌ／Ｌ，氯化物１２０ｍｍｏｌ／Ｌ。
颈椎ＭＲＩ：多发椎体异常信号伴硬膜增厚（图１）。
头颅ＭＲＩ示：双侧额叶、侧脑室旁多发斑点状异常信号（图２）。
高度怀疑颈部与颅内异常信号为转移性肿瘤，但骨髓穿刺、腹部Ｂ超、腹部ｃＴ、颈部淋巴结活检均未发现异常。
图１治疗前、后颈椎ＭＲＩＡ：该患者治疗前颈椎ＭＲＩ：在颈２—４椎体有异常信号，并有硬脊膜增厚；Ｂ：治疗后同一部位的ＭＲＩ：可见原先的异常信号降低，硬脊膜增厚略有减轻。
图２头颅ＭＲＩ可见侧脑室旁有圆形异常信号。
２．结果用ＴＳＰＯＴＴＢ检测该患者血液标本，结果阳性（图３）。
于是对该患者行诊断性抗结核治疗，方案为四联（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇），同时加用甲泼尼松３０ｒＩｌｇ。
治疗３ｄ后，患者体温平，治疗１周后，患者颈部疼痛好转，左上肢肌力逐渐恢复，２周后，患者左上肢肌力基本恢复正常。
复查颈部ＭＲＩ示：原先异常信号减弱，硬脊膜增厚减轻（图ｌＢ）。
患者出院时仍维持四联抗结核治疗，激素减为泼尼松２０ｍｇ，嘱患者随访。
从该患者的治疗反应诊断为结核性脑脊髓膜炎和椎体结核。
图３该病例的ＥＬＩＳＰＯＴ结果１：阴性对照孔；２．为阳性对照孔；３、４：实验孔。
图中可见第３孔中出现大量斑点，为阳性结果。
每个斑点代表１个分泌ＩＦＮ．７的Ｔ细胞。
用计算机辅助成像技术进行斑点计数得到４个孔的斑点数分别为２、８３２、４０１和０。
３．讨论该患者是肺外结核感染，缺乏典型的结核中毒症状，如消瘦、盗汗等，影像学检查发现颈椎、头颅有异常信号，从形态学上倾向于转移性肿瘤，但对常见肿瘤的筛查未发现原发肿瘤的迹象，脑脊液检查只有蛋白较高，细胞数无明显升高。
探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值
探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值探讨结核感染T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值引言：结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，全球范围内仍然是重大公共卫生问题之一。
早期和准确的结核病诊断对于控制疾病的传播和提供有效的治疗举措至关重要。
近年来，结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）逐渐成为结核病的主要诊断工具之一，本文将探讨T-SPOT.TB在结核病中的诊断价值。
一、T-SPOT.TB的原理与技术：T-SPOT.TB是一种利用酶联免疫斑点法检测结核分枝杆菌特异性T细胞反应的技术。
该方法基于测量体外T细胞的干预和测量干预期间T细胞产生的干预细胞因子的原理，通过寻找和计数结核分枝杆菌特异性T细胞的干预斑点来判断人体是否感染了结核分枝杆菌。
二、T-SPOT.TB的优势：与传统的结核诊断方法相比，T-SPOT.TB具有以下显著的优势：1. 高度特异性：T-SPOT.TB能有效区分结核病与非结核分枝杆菌感染，降低了假阳性率，提高了诊断的准确性。
2. 高敏感性：T-SPOT.TB能更早地检测出结核感染，尤其是对于免疫缺陷患者和隐性感染者具有更高的敏感性。
3. 快速结果：T-SPOT.TB的检测结果通常在24小时内可得，对于紧急情况和迅速诊断起到了关键作用。
4. 无交叉反应：T-SPOT.TB不受BCG疫苗和其他非结核分枝杆菌感染因素的影响，避免了传统诊断方法的交叉反应。
三、T-SPOT.TB在结核病中的诊断价值：1. 早期诊断：由于T-SPOT.TB的高敏感性，它能够早期检测出结核感染，避免了疾病的进一步传播，为尽早治疗提供了依据。
2. 预测疾病进展：通过监测T细胞反应的变化，T-SPOT.TB可以评估结核感染的严重程度和预测患者的疾病进展，以便采取及时的干预措施。
3. 监测治疗效果：T-SPOT.TB可以用于评估结核患者的治疗效果，及时调整治疗方案，提高治疗的效果。
4. 作为筛查工具：T-SPOT.TB可以作为结核病的筛查工具，在高感染风险群体中进行广泛的应用，以便早期发现结核感染，减少疾病传播。
T-SPOT.TB产品简介
结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）一、T-SPOT.TB产品介绍我国是世界上仅低于印度的第二大结核病国家。
受限于检测手段，中国的结核感染率较难准确统计，2009年流行病调查结果为总人口的44.5% （因采用PPD检测，假阳性较多）。
而年新发活动性结核患者超过107万人次，年死亡人数达13万。
结核病的早期快速诊断已经成为制约结核病控制的关键因素。
目前，常规结核感染实验室检测方法诊断检出率不到50％。
2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）发出正式声明，要求禁止将血清学检测方法用于肺结核和肺外结核的诊断。
因此，开发特异、敏感、快速、简便的结核病感染的诊断方法已经成为全球共识。
结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB））是由英国Oxford Immunotec 公司研发生产的体外诊断产品，用于结核感染的筛查，结核病辅助诊断及疗效评价等。
它改变了以往的结核检测方法特异性低，敏感度差，耗时长的缺点。
作为当前全球最先进的结核感染诊断产品，该产品已经成为发达国家结核感染检测的首选方法，获得欧盟CE 认证、美国FDA认证。
美国CDC、美国胸科学会、英国及欧洲的结核病防治指导原则中，均已将本试剂盒方法列为结核感染诊断的推荐实验室诊断标准，并已经在欧洲（英国、德国、法国、意大利、瑞士、西班牙、爱尔兰、荷兰、丹麦、挪威、瑞典）、北美洲(加拿大、美国)、非洲（南非）、澳大利亚、亚洲（韩国、新加坡、日本、中国）等国家均已上市销售，并写入部分国家的诊疗指南中。
T-SPOT.TB用于结核感染的诊断与鉴别诊断具有独特优势：高灵敏度和特异性:特异性达到97.1％（美国FDA临床研究数据），敏感度达到95.6％（美国FDA临床研究数据），不受环境分枝杆菌感染和卡介苗（BCG）接种影响基本不受机体免疫抑制影响，适用于HIV感染和免疫抑制剂治疗人群简单的实验室血液检查，24小时快速报告结果结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）应用的方法学为酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。
Tspot结核感染T细胞斑点试验的临床应用
“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞 “无反应性”结果表明样本中可能不存在针对结核杆菌特异的效应
T细胞
二、结果的判断(影响因素分析)
既往结核病史或影像学提示陈旧性肺结核、有结核 密切接触史或高潜伏性结核感染率可使其诊断活动 性结核病的特异性降低。
一、T-SPOT.TB的原理
外周血T-SPOT即利用酶联免疫斑点技术 （ELISPOT）通过检测结核分枝杆菌特异性抗 原刺激后外周血单个核细胞释放的γ-干扰素来 检测抗原特异性 Ｔ淋巴细胞的应答反应，从而 判断结核感染状态。
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞， 记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T 细胞数量。
二、结果的判断
试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP-10)、阳性 对照组(植物血凝素PHA)。
通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而PHA对照 孔斑点数超过20个。
空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。
当PHA对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确 定”。
二、结果的判断
如果抗原A和/或抗原B有应答，检测结果为“有反应性”，参照 以下标准：
空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）（空白对照孔斑点数）≥6；
空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数） ≥2×（空白对照孔斑点数）；
检测结果为“无反应性”：不符合上述标准且PHA对照孔正常。 当PHA对照孔结果为“不确定”且抗原A和抗原B孔结果都为“无
有学者指出：
诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成 细胞中位数为442SFCs/10^6 PBMC 。
骨科结核感染T细胞斑点检测(SPOT)
骨科临床应用（二）
酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测在骨结核中的诊 断价值
Lai CC, et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011
C.-C. Lai, et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011
2007年3月至2010年6月，本研究共纳入台湾一所三级保健医院 36例疑诊骨结核的患者（21例排除结核）
ELISPOT检测可辅助诊断骨结核，阴性结果可排除脊柱结核
骨科临床应用（三）
Cho et al. Journal of Infection (2011) 63, 362-369
对疑似肺外结核患者进行 T-SPOT.TB 检测。 针对不同感染部位的 T-SPOT.TB 检测灵敏性如下表所示：
作者认为： “这 些结果表明，不 管免疫状态如何 和培养阳性与否， T-SPOT.TB 检测 有助于排除像淋 巴结结核和骨关 节结核一类的慢 性结核病。
24 小 时 报 告 结 果
阴性结 果
实验效果图
空白对照
抗原A ESAT-6
抗原B CFP10
阳性对照 （PHA）
阴性结果：A抗原或B抗原 斑点数均小于6
阳性结果：A抗原或B抗原
阳性结 果
斑点数任意一个大于等于6，
实验结果解释
•阴性结果意义
提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。
排除结核感染——排除结核病——帮助临床鉴 别诊断 •阳性结果意义
CDC指南 高危患者考虑TST和IGRA任何阳性结果应该被认为 LTBI的证据
使用抗TNF-a治疗前的抗结核治疗(北京
胸科医院）
• 仅仅T-SPOT结果阳性，无其它结核表现，可预防性抗结核治 疗3-6个月。
QB—SPOT结核实验
QB—SPOT结核实验
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是一种运用IGRA技术，检测被结核分枝杆菌特异的早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP 10）分别刺激后释放γ-干扰素的效应T淋巴细胞，以辅助诊断结核感染的实验室检测技术。
TBspot试验通常指T-SPOT试验，即结核杆菌感染T细胞斑点试验，又称为结核菌感染干扰素释放试验，是利用结核特异性抗原，通过酶联免疫斑点技术，检测受试者体内是否存在结核效应的T淋巴细胞，从而判断被检查者是否感染结核杆菌。
该检查的原理是结核杆菌感染之后，T淋巴细胞会形成免疫记忆。
通常在体外分离到T淋巴细胞之后，培养增殖T细胞的同时，用相应的特异性抗原，进行刺激，激活T细胞记忆，有记忆的细胞则会分泌大量的干扰素。
结核T-SPOT检查即为结核菌T细胞斑点检测，是临床用于诊断结核病的新型检查方法。
通过检测干扰素的量，判断该细胞是否存在结核感染形成的记忆，进而通过进一步的反应判断是否存在结核菌感染。
但它的结果不能作为单独或决定性诊断活动性结核的证据，阳性结果仅提示患者体内存在结核杆菌特异性的效应T细胞。
但是否为活动性结核，则需要结合患者的临床症状及其他检测指标，进行综合判断。
现在已经有多项研究的结果显示，T-SPOT试验只能判断是否感染过结核，但无法鉴别活动性结核与潜伏性结核，因此对于活动性结核的诊断价值有限。
结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析
结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析结核病是公共卫生中的一种常见传染性疾病，其在传染性疾病致死中所占的比重一直比较高，也是公共卫生需要长期关注的疾病。
结核病在临床上主要表现为咯血、咳痰、肺部空洞等症状，具有不易控制、易复发、具有发病率高、耐药率高等特点，严重影响患者的生活质量，也对人口生命健康危害极大，故早期进行准确鉴别诊断，指导临床治疗，对改善患者预后具有重要意义[1-2]。
痰培养结核分枝杆菌是临床诊断结核病的“金标准”，但存在检测时间较长、结核细菌生长缓慢、对于技术人员要求较高等不足，不利于早期诊断，难以满足临床需要。
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)属γ干扰素释放试验类型，是诊断肺结核的重要途径，其采取特异性结核分枝杆菌抗原，当前在临床上得到广泛使用[3]。
现就该项目技术进展及现状报道如下：1结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）原理和特点1.1 γ干扰素释放试验（IGRA）简介目前用于临床γ干扰素释放试验（IGRA）主要有两种，一种是QFT-GIT试验，该试验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结核特异性抗原刺激致敏T细胞释放γ干扰素浓度。
另外一种就是结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），该试验的方法是采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测外周血结核特异性抗原刺激分泌IFN-γ的Ｔ淋巴细胞数量[4]。
IGRA已有20多个国家发布了应用指南[5],2014年中华医学会结核病学分会和《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织相关专家发布了《γ干扰素释放试验在中国应用的建议》，对IGRA在活动性结核病及潜伏性结核（LTBI）诊断的应用建议。
2017年卫健委发布卫生标准WS288-2017《肺结核诊断》中将γ干扰素释放试验（IGRA）阳性作为结核病诊断实验室检查项目。
卫健委于2020年4月2日发布的《中国结核病预防控制工作技术规范》中明确结核潜伏感染检测方法、人群及预防性治疗方案。
T 细胞斑点试验
T 细胞斑点试验( T SPOT -TB)在结核性脑膜炎早期诊断中的意义探讨结核病（Tuberculosis，TB）被称为“白色瘟疫”，已经演变为全球性公共卫生问题，而结核性脑膜炎（Tuberculous Meningitis，TBM）在结核病中的发病率为10％-20％，是最常见、最严重的肺外结核病，死亡率为15％-30％，致残率和致死率高。
其预后与早期诊断从而早期治疗有密切关系。
但由于结核性脑膜炎早期临床表现及脑脊液改变特异性差，与病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎等疾病较难鉴别，目前国内外尚缺乏理想的早期诊断方法。
结核性脑膜炎常用的实验室诊断方法主要有脑脊液细菌培养、脑脊液抗酸染色、脑脊液常规生化、结核抗体检测、PPD试验等，结核性脑膜炎确诊的金指标为脑脊液培养结核菌生长或脑脊液抗酸染色找到结核杆菌，但上述检测方法特异性和灵敏性尚不令人满意，给结核性脑膜炎的早期诊断带来了困难。
T 细胞斑点试验（T SPOT -TB）则是利用酶联免疫斑点法（ELISPOT法）探测结核感染者的特异性T 细胞来诊断结核的一种新方法，该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在于致病性结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。
RD1编码产生的ESAT-6和CFP-10（culture filtrate protein）作为特异性抗原刺激机体T 淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-γ。
根据这一原理，T SPOT -TB试验是利用结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存在结核感染特异性T 细胞，这些T 细胞在受到致病性结核杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-γ而设计的T 细胞免疫斑点试验。
酶联免疫斑点法（ELISPOT法）检测特异性淋巴细胞筛查结核患者现已应用于欧美各国临床诊断中，而在国内仅处于试验性诊断阶段。
众所周知，结核性脑膜炎的免疫学反应与肺结核等颅外结核感染并无二致，故推测该方法亦可用于结核性脑膜炎的早期诊断。
T-SPOT与预防性抗结核治疗
潜伏性结核感染：无结核中毒症状，无影像学等临床检查证据，根据发展为活动性结核
病风险程度决定是否进行预防性抗结核治疗 非结核分枝杆菌感染：4种环境分枝杆菌的感染（海、堪萨斯、苏尔加、戈登分枝杆菌） 结核菌素试验TST所致T-SPOT假阳性：需同时检测T-SPOT和TST时，T-SPOT的血样最好 在TST实验前或者实验后3天内采取
与是否排菌无关。
我院T_SPOT.TB试验结果
结核病中的敏感性为83.2%,特异性为81.6%,阳性预测值为64.5%,阴 性预测值为92.3%。 肺外结核组的阳性率低于肺结核，结核性胸腔积液患者，抽取积 液行T-SPOT TB，其阳性率高于血标本。
结核患者中,免疫抑制状态与糖尿病对T-SPOT结果无明显影响。
外周血T-SPOT即利用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）通过检 测结核分枝杆菌特异性抗原刺激后外周血单个核细胞释放的γ干扰素来检测抗原特异性 Ｔ淋巴细胞的应答反应，从而判断 结核感染状态。
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，记数斑点数量可
以获得外周血中结核致敏的T细胞数量。
T_SPOT.TB的原理
危险因素
T_SPOT.TB 特点
既往结核病史或影像学提示陈旧性肺结核、有结核密切接触史 或高潜伏性结核感染率可使其诊断活动性结核病的特异性降低。 只与外周血中结核特异性抗原刺激产生的效应T细胞有关，与感 染部位无关。 受年龄、机体免疫状态、HIV感染、营养不良等影响较小。
抗结核治疗后效应T细胞消失，可使斑点数减少或使结果呈阴性。
03
长期应用异烟肼患者可予以服用维生素B6预防周围神经炎，同时应
注意监测肝功能
矽肺患者 透析治疗患者
预防性抗结核治疗方案
T淋巴细胞斑点试验在结核病诊断中的临床意义
T淋巴细胞斑点试验在结核病诊断中的临床意义目的：评价结核酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）在快速诊断结核病的临床意义。
方法：对我院确诊或疑诊结核患者进行T-SPOT.TB 检测，检测其诊断结核病的灵敏度及特异度。
结果：在结核性疾病T-SPOT TB检测灵敏度为90%（72/80），特异度为91.2%（62/68）。
肺结核组T-SPOT.TB检测灵敏度为92.8 %（52/ 56），结核性胸膜炎组，检测灵敏度为83%（20/24）。
结论：T-SPOT.TB 试验在临床诊断结核中，快速且敏感，对结核性疾病诊断有重要价值。
标签：酶联免疫斑点试验；结核病；灵敏度；特异度结核病是危及人类健康的重大公共卫生问题之一，我国流行病学调查发现在我国每年因结核病导致的死亡人数达到13万人[1]，且有逐年上升的趋势。
传统的结核菌素皮试（TST）及结核菌素纯蛋白衍生物作为结核感染诊断技术，其敏感性及特异性较差，导致很多的结核病人漏诊和误诊，延误了治疗。
发展能用于诊断结核的快速敏感的实验室技术成为当前医学界迫切之需。
酶联免疫斑点（enzyme linked immunospot assay，EL ISPOT）技术是一种新型的免疫酶技术，从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞。
由EL ISPOT发展而来的结核感染T细胞斑点试验技术（T-SPOT.TB），使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PB-MC），通过细胞因子γ干扰素（IFN- γ）的分泌检测抗原特异性T淋巴细胞的应答反应，从而判断结核感染状态，具有较高的敏感性和特异性[2]。
Kim等[3]随诊72例疑似肺外结核患者的前瞻性研究显示，对于活动性肺外结核，T-SPOT.TB和PPD的敏感性分别为94%和47%，本文就T-SPOT.TB检测对结核性疾病的诊断价值进行初步探讨，为结核病的早期诊断及疗效判断提供一种快捷、灵敏的方法。
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结核感染T细胞（T-SPOT.TB）
一、名称
结核感染T细胞（T-SPOT.TB）
二、项目简介、临床意义及收费标准
T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，其灵敏高于ELISA方法。
该检测通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。
该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况，其诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
收费标准：740元/人份，收费依据：混合淋巴细胞培养（W0309050020）（250元）×2次；干扰素测定（W0309060008）（120元）×2种抗原。
三、标本采取
1.静脉血：肝素锂（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，
以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
2.脑脊液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混
匀。
3.浆膜腔积液（胸水、腹水、心包积液）：无菌密闭容器留取50ml以上，每100毫
升加2500IU（0.4ml）抗凝并立即混匀。
4.关节液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混
匀。
四、检测时间、报告时间
检测时间：每周二（节假日除外）进行检测，标本必须在上午9点前送达实验室。
报告时间：周三出报告。
五、注意事项
1.标本采集后4小时内必须送到实验室进行检测，标本采集后如果超过4小时未送
检将严重影响检测结果。
2.检测脑脊液、浆膜腔积液、关节液，须同时送检静脉血。
3.冬季运送标本时注意保温，避免冷冻。
六、联系科室和电话
检验科微生物室(TeL：84205491)。