3 Geneup生物技术有限公司产品目录-Cas9 V2 2015

2. pLVc-505 (pLVc/U6.sgRNA-Bla-P2A-EGFP)
载体特点： � 使用人 U6 启动子表达 sgRNA 序列； � 用 BsmB1 酶切载体，与 crRNA 插入片段连接； � 含有 EGFP 标记基因，可以实时跟踪转染效率； � 含有杀稻瘟菌素(Blasticidin)抗性筛选基因，可筛选稳定表达细胞系； � 既可用瞬时转染，也可包装成慢病毒后感染细胞； � 设计 crRNA 插入片段的引物结构为 上游引物： 5`-ACCG NNNN NNNNN NNNNN NNNNN-3’ 下游引物： 3`- NNNN NNNNN NNNNN NNNNN CAAA-5’ （三）sgRNA/Cas9 共表达载体 1. 常规质粒载体 (pCas9 V1.0)
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第三类 CRISPR/Cas9 系列
一、CRISPR/Cas9 技术简介 CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ）是 来自细菌及古细菌的一套特异性免疫系统。 在该系统中， crRNA （CRISPR-derived RNA）与 tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成的复合物能特异性识别靶基 因序列，并引导 Cas9 核酸内切酶在靶定位点剪切双链 DNA，从而达到对目的基 因组 DNA 进行特异性编辑。自 2013 年 1 月首次报道利用 CRISPR/Cas9 系统可 以对哺乳动物细胞进行基因组改造以来， CRISPR/Cas9 系统高效的基因组编辑功 能已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、 植 物 及 细 菌 。 研 究 表 明 ， 与 锌 指 核 酸 酶 （ ZFNs ） 和 转 录 激 活 样 效 应 核 酸 酶 （Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas 系 统介导的基因组靶向实验在细胞或动物中具有相似甚至更高的效率。
载体特点：
� � 使用人 U6 启动子表达 sgRNA 序列； 用 Bbs1 酶切载体，与 crRNA 插入片段连接。
2. 基于 EBNA1 和 oriP 的载体 (pEP-KO) 基于 EBNA1 和 oriP 元件的非整合型附着体载体（Episomal vector）导入真 核细胞后，则以游离体方式转运入核，载体上携带的目的基因能够获得较高水平 表达，并随着细胞分裂保持较长时间，但最终会将逐渐去除。
� 既可用瞬时转染，也可包装成慢病毒后感染细胞； � 与第四代慢病毒包装质粒匹配，可制备高滴度慢病毒颗粒。 载体图谱：
为什么要选择诱导型 Cas9 表达体系？ 利用 Cas9 技术可以进行高通量筛选，现有的做法是在 Cas9 稳转细胞系上进行操作。 研 究表明，Cas9 的持续表达对细胞会产生一定的毒性，因此我们开发了诱导型 Cas9 过表达慢 病毒载体，可以方便地构建稳转细胞系。当对细胞转染过表达 sgRNA 的载体或者体外合成 的 sgRNA 时， 加 Dox 便可诱导 Cas9 表达并启动对靶 DNA 的编辑， 一旦剪切筛选任务结束， 更换为不含 Dox 的培养液，便可有效避免由于 Cas9 持续表达对细胞造成的各种毒副作用。
图 1：CRISPR/Cas9 技术编辑基因原理示意图
二、利用 CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除的优点 1. 可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除； 2. RNA 导向的基因组 DNA 识别，无需考虑 DNA 甲基化； 3. 无种属限制，适用于各种细胞系的靶向敲除； 4. 系统灵活简单，敲除效率更高。 三、Geneup 公司研发的 Cas9 相关产品及服务 （一）诱导型 Cas9/Cas9n 过表达慢病毒载体 (pLVi-503，pLVi-504) 载体特点： � 使用改良的四环素反应元件 （TRE3G） 和反义四环素转录激活子 （TETON3G） 并反向克隆到同一慢病毒载体，显著提高了诱导效果，并降低了本底，在非 诱导条件下几乎检测不到“泄漏”的人源化 Cas9 蛋白； � 加入药物 Dox 时，TETON3G 与其结合后发生构象改变并结合到 TRE3G 位 点，从而促使 miniCMV 启动子控制下的 Cas9 或者 Cas9n 的表达； � 含有嘌呤霉素（puromycin）抗性筛选基因，可筛选稳定表达细胞系；
载体特点：
� � � 使用人 U6 启动子表达 sgRNA 序列； 含有嘌呤霉素（puromycin）抗性筛选 基因，可筛选转染后的细胞； 用 Sap1 酶切载体， 与 crRNA 片段连接。
服务内容 1. 靶向目标序列 sgRNA 载体构建 2. 诱导型 Cas9/Cas9n 稳转细胞系的构建 服务价格
（二）sgRNA 过表达慢病毒载体 1. pLVc-502 (pLVc/U6.sgRNA-copGFP-Puro)
载体特点： � 使用人 U6 启动子表达 sgRNA 序列； � 用 BsmB1 酶切载体，与 crRNA 插入片段连接； � 含有 copGFP 标记基因，可以实时跟踪转染效率； � 含有嘌呤霉素（puromycin）抗性筛选基因，可筛选稳定表达细胞系； � 既可用于瞬时转染，也可包装成慢病毒后感染细胞； � 设计 crRNA 插入片段的引物结构为 上游引物： 5`-ACCG NNNN NNNNN NNNNN NNNNN-3’ 下游引物： 3`- NNNN NNNNN NNNNN NNNNN CAAA-5’
服务项目 内容 sgRNA 克隆服务 每个靶基因设计 3 条 sgRN