病毒培养技术 (1)
新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)
附件4新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）为指导各级疾控部门和其他相关机构开展新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测工作，特制定本技术指南。
本指南主要介绍目前已经比较成熟、易于实施的核酸检测方法。
一、标本采集（一）采集对象。
新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者，其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他需要进一步筛查检测的环境或生物材料（如溯源分析）。
(二)标本采集要求。
1.从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训（培训合格）和具备相应的实验技能。
采样人员专业防护装备（personal protective equipment，PPE）要求：N95口罩、护目镜、防护服、乳胶手套、防水靴套；如果接触患者血液、体液、分泌物或排泄物时，戴双层乳胶手套。
2.住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。
3．密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。
4．根据实验室检测工作的需要，可结合病程多次采样。
（三）标本采集种类。
每个病例必须采集急性期呼吸道标本和急性期血液标本；重症病例优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液等），可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。
其他研究材料依据设计需求采集。
标本种类：1．上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。
2．下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。
3．血液标本：尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血。
采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用含有抗凝剂的真空釆血管采集血液。
4.血清标本：尽量釆集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）釆集，第二份血清应在发病后第3～4周釆集。
采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用真空釆血管。
（四）标本采集方法。
1．咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
病毒培养的原理和流程
病毒培养的原理和流程英文回答：Principle of Virus Culture.Virus culture is the process of growing viruses in a living host system, such as cell culture or animals. The purpose of virus culture is to isolate and propagate viruses for diagnostic, research, or vaccine development purposes.Viruses are obligate intracellular parasites, meaning they require a living host cell to replicate. In virus culture, viruses are introduced into a host system that is permissive to their growth. The permissive host system provides the necessary cellular machinery and nutrients for the virus to replicate.Process of Virus Culture.The process of virus culture typically involves the following steps:1. Specimen collection: A specimen containing the virus of interest is collected from the patient or the environment.2. Sample preparation: The specimen is processed to remove any contaminants or debris that could interfere with virus culture.3. Inoculation: The prepared sample is inoculated intoa permissive host system. This can be done by injecting the sample into the host, adding the sample to a cell culture, or exposing the host to the sample through the respiratory tract or other routes of infection.4. Incubation: The inoculated host system is incubated at a temperature and environment that is optimal for virus growth.5. Observation: The host system is monitored for signsof virus growth. This can include changes in cell morphology, the presence of viral inclusions, or the development of cytopathic effects (CPE).6. Harvesting: Once the virus has grown to a sufficient titer, it can be harvested from the host system. This can be done by collecting the infected cells or fluids from the host.7. Isolation: The harvested virus can be further isolated and purified using techniques such as plaque isolation or monoclonal antibody purification.中文回答：病毒培养的原理。
病毒培养方法
病毒培养方法病毒培养是研究病毒特性和生物学行为的重要手段，也是疫苗和抗病毒药物研发的基础。
正确的病毒培养方法能够保证病毒在细胞内稳定生长，为后续实验提供可靠的数据支持。
下面将介绍一般的病毒培养方法。
首先，选择合适的宿主细胞。
不同种类的病毒需要不同的宿主细胞进行培养，常用的宿主细胞有Vero细胞、HEK293细胞、MDCK 细胞等。
在选择宿主细胞时，需要考虑病毒对细胞的亲和性和感染能力，确保病毒能够有效地感染和复制。
其次，培养宿主细胞。
宿主细胞的培养条件对病毒的生长和复制起着至关重要的作用。
通常情况下，宿主细胞需要在无菌条件下培养，培养基的选择和配方也需要根据不同的宿主细胞进行调整。
在培养过程中，需要定期更换培养基，控制培养密度，以确保细胞的健康状态。
接着，感染宿主细胞。
将病毒悬液加入到培养基中，使病毒与宿主细胞发生感染。
感染后的细胞需要在适当的温度和湿度条件下进行培养，促进病毒的复制和扩散。
在感染后的一段时间内，可以观察细胞的形态变化和病毒效应，以判断感染情况。
最后，收获病毒。
当感染细胞出现明显的病毒效应并且病毒滴度达到一定水平时，可以收获病毒。
收获病毒时需要注意保持病毒的活性和纯度，通常采用离心、滤过等方法进行病毒精制。
收获的病毒可以用于后续的实验研究，也可以用于疫苗和药物的研发。
总之，病毒培养是病毒学研究中不可或缺的一环，正确的病毒培养方法能够保证病毒的活性和稳定性，为后续的实验提供可靠的数据支持。
在进行病毒培养时，需要严格控制培养条件，确保实验的可重复性和准确性。
希望本文介绍的病毒培养方法能够对研究人员有所帮助，促进病毒学研究的发展。
病毒性疫苗制造技术
病毒性疫苗制造技术任务一灭活苗的制造流程菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活↓↓配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩工序一菌种与种子培养选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。
种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。
大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。
如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。
工序二菌液的培养用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。
可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。
一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。
因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。
实例大肠杆菌的菌液培养方法(1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。
(2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。
(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。
如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。
吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。
如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
人工培养病毒的方法
人工培养病毒的方法
人工培养病毒是一项重要的实验技术，它在病毒学研究以及疫苗生产等领域具有重要意义。
下面将介绍人工培养病毒的方法。
首先，选择合适的宿主细胞是人工培养病毒的关键。
不同的病毒对宿主细胞有不同的选择性，因此需要根据病毒的特性选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞包括Vero细胞、MDCK细胞、HEK293细胞等。
其次，培养基的选择也是至关重要的。
培养基中的营养物质和生长因子对病毒的生长和繁殖起着至关重要的作用。
一般来说，培养基中需要含有足够的营养物质和生长因子，以满足病毒的生长需求。
接着，病毒的接种和感染是人工培养病毒的关键步骤。
在选择好宿主细胞和培养基之后，需要将病毒接种到宿主细胞中，使其感染并开始复制。
这一步需要严格控制感染的条件，以确保病毒能够有效地感染宿主细胞。
随后，对感染后的细胞进行培养和观察。
在感染后，需要将细
胞继续培养，并观察病毒的生长情况。
这一步需要耐心和细心，以
确保病毒能够充分地复制和繁殖。
最后，收集和提取病毒。
当病毒充分复制后，需要进行病毒的
收集和提取。
这一步需要使用适当的方法，如离心、超声波破碎等，将病毒从细胞中提取出来，并进行纯化和浓缩。
总之，人工培养病毒是一项复杂而重要的实验技术，它需要在
选择宿主细胞、培养基、感染和观察等方面进行严格控制，以确保
病毒能够充分复制和繁殖。
只有这样，我们才能更好地理解病毒的
生物学特性，为疫苗研发和病毒学研究提供重要的支持。
制备乙肝疫苗关键技术
制备乙肝疫苗关键技术乙肝疫苗是预防乙型肝炎的主要手段之一，它通过引入乙肝病毒表面抗原（HBsAg）来激发人体免疫系统产生特异性抗体，从而达到预防乙型肝炎的效果。
乙肝疫苗的制备主要包括以下几个关键技术：1. 病毒培养技术：乙肝疫苗的制备需要大量的乙肝病毒，因此首先需要通过细胞培养技术来大量培养乙肝病毒。
常用的乙肝病毒培养细胞包括CHO细胞和酵母细胞等。
这些细胞能够提供足够的细胞质环境，使乙肝病毒能够进行正常的生长和复制。
2. 病毒纯化技术：在病毒培养完成后，需要对培养液进行纯化处理，以去除杂质和非病毒成分。
常用的纯化方法包括超速离心、膜过滤和柱层析等。
通过这些技术，可以将乙肝病毒从培养液中分离出来，并获得相对纯净的乙肝病毒样品。
3. 抗原提取技术：乙肝疫苗的关键成分是乙肝病毒表面抗原（HBsAg），因此需要将从纯化的乙肝病毒中提取出HBsAg。
一般采用酸沉淀法或柱层析法来提取HBsAg。
提取后的HBsAg可以用于制备乙肝疫苗的主要原料。
4. 适应性毒株培养技术：为了提高乙肝疫苗的免疫效果和安全性，研究人员常常会通过传代培养等技术来培养适应性毒株。
适应性毒株是指经过多次传代培养后，乙肝病毒的毒性和免疫原性均得到增强的病毒株。
使用适应性毒株制备的乙肝疫苗可以更好地激活人体免疫系统，从而提高疫苗的免疫效果。
5. 疫苗制剂技术：乙肝疫苗的最终制剂通常是液体制剂或冻干粉剂。
制备乙肝疫苗的过程中，需要加入一定的辅助成分，如防腐剂、稳定剂和缓冲剂等。
这些辅助成分可以提高疫苗的稳定性和保存性能，保证疫苗在贮存和使用过程中的效果。
总结起来，制备乙肝疫苗的关键技术包括病毒培养、病毒纯化、抗原提取、适应性毒株培养和疫苗制剂等。
这些技术的应用使得乙肝疫苗的制备更加高效和安全，为预防乙型肝炎提供了有力的保障。
未来，随着生物技术的不断进步和创新，乙肝疫苗的制备技术也将不断完善，为乙型肝炎的防控工作做出更大的贡献。
第十二章病毒的培养
第十二章病毒的培养一、实验动物二、鸡胚三、组织培养(一)组织（块）培养(二)器官培养(三)细胞培养(四)组织和细胞的培养方法(五)细胞克隆技术(六)细胞的保存四、病毒的组织培养五、病毒蚀斑技术病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。
因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。
而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。
培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。
在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。
一、实验动物实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。
但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。
为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。
GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。
GN是确知所带微生物的动物。
只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。
SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。
从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。
微生物培养技术
微生物培养技术一、学习目的微生物培养技术是研究微生物的基础，也是现代微生物技术的基石。
微生物培养是生物培养的中的一种。
所培养的微生物主要有病毒、细菌、放线菌、真菌等。
微生物培养需要用到培养基，根据微生物的不同种类和生活习性来配制特定的培养基。
微生物培养成功的关键在于无菌操作，如果培养器具和培养基不能彻底灭菌、培养的过程中有杂菌污染是很容易失败的。
在本章中，同学们将学习与微生物培养相关的技术，如消毒灭菌技术、培养基制备技术和微生物接种、分离纯化技术等。
二、技术介绍1、消毒灭菌技术：消毒是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。
通常用化学的方法来达到消毒的作用。
用于消毒的化学药物叫做消毒剂。
灭菌是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，通常用物理方法来达到灭菌的目的。
灭菌是彻底的消毒，灭菌虽然要求达到无菌，但实际上是很困难的，一般规定灭菌后微生物生长几率应补高于10-6，工业上一般认为100万个处理对象中仅有一个带菌时可视为无菌。
常用的消毒灭菌技术有：（一）加热灭菌使用加热灭菌法，在温度和压力等规定的灭菌条件下，要达到一定的加热时间，因灭菌物品的性质、灭菌容器的容积大小各异，所以，灭菌时间是从容器内全部达到规定的温度时开始计算。
1、火焰灭菌法，是利用火焰加热杀灭微生物的一种方法。
本办法以燃气为主，用于磁制与金属制口及在火焰中不会破损的物品。
加热时间通常在喷灯或酒精的火焰中加热秒以上。
2、干热灭菌法，是利用干热空气加热杀灭微生物的一种方法。
本办法以燃气为主，用于磁制、金属制若干物品，纤维制物品，矿物油、脂肪、脂肪油、试验药物、固态的医药品等耐高温的物品；利用燃气和电能直接加热空气，将加热的空气进行循环，保持干燥与高温状态。
通常，在以下几种条件下进行灭菌。
135℃～145℃3～5小时；160℃～170℃2～4小时；180℃～200℃0.5～1小时；200℃以上0.5小时以上。
在密封容器中装入医药品、水溶液等，这些物品属耐高温的物品，可用134℃～138℃的热空气，加热3分钟以上进行灭菌。
病毒的鸡胚培养法
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
病毒培养总结
引言
病毒培养是一项关键的实验技术，在病毒学研究和生物工程等领域具有重要的应用价值。本文将对病毒培养的关键步骤、培养方法以及常见问题进行总结和分析，以期提供一个全面的病毒培养指南。
病毒培养的关键步骤
步骤一：准备工作
在病毒培养前，需要准备一系列的实验材料和设备。首先，需要选择合适的细胞系，根据病毒类型选择相应的培养基，并加入适量的抗生素以预防细菌感染。此外，还需要一些培养皿、离心管、培养箱、生物安全柜等实验设备。所有的材料和设备都应进行严格的消毒和清洁，以确保实验的准确性和可靠性。
结论
病毒培养是一项关键的实验技术，需要进行准备工作、细胞接种、病毒感染、病毒增殖和病毒收获与纯化等关键步骤。常见的病毒培养方法包括传统病毒培养法和细胞毒性测定法。在实际操作中，可能会遇到细胞生长缓慢、病毒感染效率低、病毒纯化效果差等问题，但通过合适的解决方案和优化操作，可以获得高质量的病毒样品。病毒培养的成功与否直接关系到后续的病毒研究和应用，因此在实验中需要严格遵守操作规范，确保实验的准确性和可靠性。
步骤二：细胞接种
细胞接种是病毒培养中的首要步骤。首先，收取细胞进行培养，保持细胞处于活跃和快速增殖的状态。然后，根据实验需要将细胞接种到培养皿中，待细胞附着和扩展后，再进行病毒感染。
步骤三：病毒感染
病毒感染是病毒培养的核心步骤。将预先培养好的病毒悬液加入细胞培养皿中，使病毒与细胞发生接触并侵入细胞内。在感染过程中，需要注意病毒悬液的浓度和接触时间的控制，以及培养皿的摇床和培养温度的调节。
细胞毒性测定
细胞毒性测定是一种常用的病毒培养方法，通常用于评估病毒对宿主细胞的毒性。该方法通过感染细胞培养皿中的细胞，观察细胞形态和细胞生长情况，判断病毒对细胞的杀伤力。根据细胞的形态变化和细胞数目的变化，可评估病毒毒力的强弱。
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养是一项重要的实验技术，它可以帮助科研人员更好地了解病毒的特性和行为，为疾病的防控和治疗提供重要的参考。
在进行病毒的分离培养时，需要严格按照一定的步骤和方法进行操作，以确保实验的准确性和可靠性。
首先，进行样本的采集和处理。
样本的选择和采集是进行病毒分离培养的第一步，科研人员需要根据研究的目的和对象选择合适的样本来源，如血液、组织、分泌物等，并严格按照规范的操作流程进行采集和处理，以避免样本受到外界污染或损坏。
其次，进行病毒的分离。
病毒的分离是指将样本中的病毒与其他细胞或微生物分离开来，以便进行后续的培养和研究。
常用的方法包括离心、过滤、离心梯度离心等，科研人员需要根据具体的研究要求选择合适的分离方法，并严格按照操作规程进行实验操作。
接下来是病毒的培养。
病毒的培养是指将已经分离出的病毒在适宜的生长条件下进行增殖和繁衍，以获取足够的病毒量进行后续的研究。
常用的培养方法包括细胞培养、动物体内培养等，科研人员需要根据病毒的特性和研究需要选择合适的培养方法，并严格控
制培养条件，确保病毒的生长和繁殖。
最后，是对培养得到的病毒进行鉴定和纯化。
病毒的鉴定和纯
化是研究病毒特性和行为的重要步骤，科研人员需要借助于生物学、生物化学和分子生物学等技术手段对培养得到的病毒进行鉴定和纯化，以获取纯净的病毒制备物进行后续的研究和应用。
总之，病毒的分离培养是研究病毒学的重要手段，科研人员在
进行病毒的分离培养时，需要严格按照规范的操作流程进行实验操作，确保实验的准确性和可靠性，为疾病的防控和治疗提供重要的
科学依据。
病原微生物检测方法
病原微生物检测方法病原微生物是指能引起疾病的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
准确快速地检测和鉴定病原微生物对于疾病的预防、诊断和治疗具有重要意义。
随着科技的发展，病原微生物检测方法也在不断更新和改进。
一、传统的病原微生物检测方法1. 细菌检测：传统的细菌检测方法包括细菌培养和形态学观察。
细菌培养是将样品接种在含有适宜营养物质的培养基上，利用培养条件培养出细菌。
形态学观察则是通过显微镜观察细菌的形态和结构特征。
这种方法需要较长的时间，且存在一定的局限性，如对于难以培养的细菌或细菌数量很少的样品，检测结果可能不准确。
2. 病毒检测：传统的病毒检测方法主要包括电镜观察和病毒培养。
电镜观察是通过电子显微镜观察病毒的形态和结构特征。
病毒培养则是将样品接种在适宜的细胞培养基上，利用细胞培养条件培养出病毒。
这些方法需要较长的时间，且对设备和技术要求较高。
3. 真菌检测：传统的真菌检测方法包括真菌培养和形态学观察。
真菌培养是将样品接种在含有适宜营养物质的培养基上，利用培养条件培养出真菌。
形态学观察则是通过显微镜观察真菌的形态和结构特征。
这种方法需要较长的时间，且对于某些真菌的鉴定存在困难。
4. 寄生虫检测：传统的寄生虫检测方法主要包括显微镜检查和血液检测。
显微镜检查是通过显微镜观察寄生虫的形态和结构特征。
血液检测是通过检测患者的血液中是否存在寄生虫的相关抗体或遗传物质。
这些方法需要专业技术和设备支持，且有一定的局限性。
二、现代的病原微生物检测方法1. 分子生物学方法：分子生物学方法是一种快速、准确的病原微生物检测方法。
其中，PCR（聚合酶链反应）技术可以通过扩增病原微生物的特定基因序列来检测和鉴定病原微生物。
这种方法具有高灵敏度和特异性，且能够快速得到结果。
此外，还有实时荧光定量PCR和循环扩增反应等技术，可以进一步提高检测的灵敏度和准确性。
2. 免疫学方法：免疫学方法是通过检测病原微生物与宿主免疫系统的相互作用来进行检测和鉴定。
病毒学研究的方法和技术
病毒学研究的方法和技术病毒学是研究病毒的学科，主要关注病毒的生物学特性、分类、传播和致病机制。
病毒学的研究方法和技术种类繁多，本文将按照其研究方向和用途进行介绍。
一、病毒分类和鉴定方法病毒分类是研究病毒的基础，也是为寻找针对特定病毒的治疗手段提供重要依据。
常用的病毒分类方法包括形态学分类、生物物理化学分类、分子生物学分类等。
其中最具代表性的是分子生物学分类方法。
该方法通过对病毒遗传物质的DNA或RNA序列进行分析，建立起了病毒系统发育树，依依分类病毒，如爱滋病病毒(HIV)、流感病毒等。
利用PCR扩增技术可以快速鉴定出病毒特异性DNA/RNA序列，为病毒的快速检测和鉴定提供了重要的技术支持。
二、病毒核酸和蛋白质的分离与分析方法分离和分析病毒核酸和蛋白质是研究病毒基因组和蛋白质组成为了进一步探究病毒的生物学特性和致病机制。
常用的方法包括电泳分离、质谱分析、荧光定量PCR等。
其中，电泳分离技术被广泛应用。
根据不同的电泳方式，电泳分离技术可以分为凝胶电泳、毛细管电泳和微流管电泳等。
凝胶电泳主要用于分离病毒核酸和蛋白质；毛细管电泳主要用于分析病毒核酸序列；微流管电泳则可在微量样品中分离和分析病毒核酸和蛋白质。
质谱分析技术主要用于检测病毒蛋白质的质量、结构、组成，提供理论支持和新的治疗靶标；荧光定量PCR则是目前病毒检测中最常用的一种快速检测技术，尤其适用于新型冠状病毒检测。
三、病毒培养和检测方法病毒培养技术是研究病毒生长和复制规律的基础。
通过极端条件下的体外培养，可以从体外获得大量相同的病毒实验体，实现对病毒生物学特性的深入分析以及寻找针对特定病毒的治疗手段的研发。
病毒的检测技术主要分为传统检测和分子检测两大类。
传统检测方法包括免疫荧光技术（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，主要基于病毒特异性蛋白质或其他病毒成分的检测；分子检测技术则主要利用PCR方法，检测病毒特异性DNA或RNA序列，如RT-PCR、LAMP等。
病毒培养技术
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
病毒学实验技术
病毒学实验技术实验一鸡胚接种器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI）一．精卵的选择、孵育和检卵1.受精卵的选择1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2）最好是白克蛋3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
2.孵育1）孵箱温度保持37.5—38.5℃2）相对湿度：50-60%3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次3.检卵孵育后第4天开始，每天检卵一次。
4日卵可见血管。
未受精卵不见血管鸡胚。
死胚血管模糊，无胎动。
二．鸡胚的结构1．卵壳上有细孔，以行气体交换2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流3．气室呼吸和调节压力—卵壳孔交换4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O25．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。
6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水7．卵黄早期养分8．卵白晚期养分三．接种前处理1．做接种记号2．消毒四．接种途径卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下2）碘及酒精消毒气室端3）钢锥在气室中央锥一小孔4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚方法二：1）2）同一3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚5）封孔，续孵，弃24h内死胚2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒2）在气室端开一1.5×1.5口3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜4）滴入接种物5）胶布或透明纸封口方法二：（人工气室）1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈]2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗3）在气室端中央钻一个小孔4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒2）钢锥锥一小孔3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途二．实验步骤：1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次4.剪碎近于乳糜状5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO3期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
3．接种技术
不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。 •接种日龄：鸡胚13～14日龄。鸭胚15～16日龄，尿囊液含
量最高，平均约6～8ml，羊水约1～2ml。 •接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育 •严格防止禽胚污染
①鸡胚接种时严格无菌操作； ②定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； ③种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。
二、禽胚增殖病毒技术
（一）禽胚的选择 • SPF鸡胚
据国家标准，无22种特定病原体 • 非免疫鸡胚
应无特定病原的母源抗体， • 普通鸡胚
可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚
（二）禽胚接种途径与收获
• 绒毛尿囊膜接种法
• 尿囊腔接种法 • 卵黄囊接种法 • 羊膜腔接种法 • 静脉接种法 • 脑内接种法
• 血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。
• 血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活 30min ， 并 进 行 细 胞 毒 性 试 验 。 生 长 液 血 清 含 量 一 般 为 5 ％～20％。维持液中血清量为0%～5％。
• 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因 子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、 聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清 培养液须补加3～8种血清替代因子。
三、细胞增殖病毒技术
1．细胞培养的概念
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物 组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。
细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 • 原代细胞(primary cell) • 细胞株(cell strain) • 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性 均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系
2．细胞培养方法
• 静置培养 • 转瓶培养 •悬浮培养(suspension cell culture ) •微载体培养(microcarrier cell culture) • 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) • 微囊化细胞培养
微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细 胞产量达106～107个/m1，每升培养液可加微载体2～5g，每 克有8000～9000个珠子，培养面积约为2～5万cm2，比常规 培养面积大10～25倍。
中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture)
•组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵
病毒增殖技术
动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)； ②对相应病毒易感，并十分敏感； ③经隔离饲养和观察检查证明健康； ④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准； ⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
细胞接种量
细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少， 这些物质分泌量少，而作用也小。 接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多 对细胞生长也不利。 鸡胚成纤维细胞为100万／m1 小鼠或地鼠肾细胞为50万／m1 猴肾细胞量为30万／ml 传代细胞为10～30万／m1
4．细胞培养污染问题
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
一般按维持液的1％～10％(V／V)量接入。 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。
6. 病毒增殖指标与收获
细胞病变(CPE)： ①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等； ②细胞聚合，如腺病毒； ③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒； ④轻微病变，如正粘病毒、冠状病毒等。 包涵体和血凝性：也可作为检查病毒增殖的指标。
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅 等材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状， 上面有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度 可达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
(1) 细菌污染 (2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。
培养液中可见黄白色小点状悬浮物 镜检时可见菌丝结构。 (3) 支原体污染：污染率为50％～60％ (4) 病毒污染 ①组织带毒 ②培养液带毒
5. 细胞培养病毒要素
（1）血清 ：维持液内犊牛血清含量一般不超过2％。 （2）温度：狂犬病病毒32℃，犬疱疹病毒36℃。 （3）pH： （4）病毒接种剂量：应以TCID50为依据
鸡胚绒毛尿囊膜接种法
尿囊腔接种法
Hale Waihona Puke 尿囊液收获方法鸡胚卵黄囊接种法
（三）影响禽胚增殖病毒的因素
1．种蛋质量
①病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。 ②母源抗体： ③抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体
2．孵化技术
①温度：37～39.5℃。传染性支气管炎病毒37℃ ②湿度：鸡胚53％～57％，水禽胚比鸡胚高5％～10％。 ③通风：氧气，二氧化碳。 ④翻蛋：