高分辨溶解(HRM)分析

HR-1

HR-1仪器是美国Idaho公司采用精确温度控制 技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用 高分辨的饱和LC Green荧光染料，使该仪器 具有较高的灵敏度和特异性。分析时不消耗被 测PCR产物样品，分析结束后PCR产物可用 于下游的分析，如测序等。
HR-1特点：
• 升温速率： 0.01 ℃ -1 ℃ / 秒 • 数据采集密度： 100 个数据 / ℃ • 使用 LC Green 荧光染料 • 反应体系 5-20ul • 分析时间： 40-45 样品 / 小时（基于 0.3 ℃ / 秒升温速率）

双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代， 当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微 克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率 缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后 来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔 解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳 克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这 样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是 SYBR® Green I。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法

双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代， 当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微 克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率 缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后 来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔 解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳 Βιβλιοθήκη Baidu级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这 样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是 SYBR® Green I。
饱和染料 对PCR没有影响，高浓度的染料饱和了DNA 双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就 不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分 辨率。目前市场上的饱和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等几种
HRM分析仪
目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包 括Idaho Technology、Corbett（QIAGEN）、Roche 等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功 能的定量PCR仪 HRM的发明者—美国犹他大学医学院的Wittwer 实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫 描上的性能。他们发现，对于大部分仪器的准确基因 分型来说，主要限制在于平板上的空间温度差异（Tm 的标准偏差为0.020-0.264°C）。其它差异如数据密 度、信噪比和熔解速率，也会影响杂合体的扫描。经 过比较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制 的仪器有着更低的Tm标准偏差（0.018-0.065），而 加热块型仪器则在0.092-0.274。
第二课 高分辨溶解（HRM）分析
hnxide@163.com

高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
2、HLA(人类白细胞抗原 ) 基因组配型 器官移植的 HLA 配型、同胞之间 HLA 基因 型确定，如快速确定 HLA 高度多态性位点的 类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移 植前的 HLA 基因型确认 。
3 、等位基因频率分析 4 、物种鉴定、品种鉴定 1 ） 微生物品种、物种快速鉴定。 2 ） 动植物品种鉴定。 5 、甲基化研究 1 甲基化位点的筛查。 2 甲基化程度分析。 用 HRM 方法检测启动子区域内的甲基化，可检测低达 0.1% 的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知 样品的甲基化百分比进行测定。 HRM 是一种高灵敏度的甲基化 检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床 应用有很大帮助。
但是当时这种熔解分析只能区分在片段大小 和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检 查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他 非特异性的扩增。如果要区分SNP，分辨率还 不够。
饱和染料和非饱和染料
非饱和染料 对PCR有抑制作用，在实验中的使用浓度 很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。 这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光 染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到 双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化， 因此出现假阴性，特异性下降
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。