高分辨率溶解曲线HRM
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率溶解曲线
北京泰格瑞分子检验有限公司高分辨率熔解曲线高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析的主要原理是由于DNA序列的片段长短，GC含量、分布以及碱基互补性差异等的不同，在DNA 分子热变性时会使溶解曲线的形状和位置有所不同。
同许多荧光PCR技术一样，HRM 利用特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测温度变化过程中双链DNA 荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测, 可以迅速的检测出核酸片段中 GC 含量和单碱基的突变。
高精度PCR 仪及饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现使HRM得到广泛的普及和应用。
项目：已知SNP位点检测；外显子突变位点筛查；物种鉴定、品种鉴定；甲基化研究；法医学鉴定、亲子鉴定。
样本要求：新鲜或异硫氰酸胍保存的细胞(﹥5×106)、组织(﹥50mg)、血液(﹥300μl)等样本原材料，或纯化好的DNA(OD260/OD280在 1.7-1.9之间)、总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)，或反转录好的cDNA不少于30μl(纯度在1.9-2.1之间，及反转录好的cRNA完整性好)。
技术优势：高通量：1 次可同时检测多个样本。
高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。
特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性强。
重复性好：样品经PCR 扩增后直接进行HRM，直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。
成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作步骤，缩短了实验时间，大大降低了使用成本。
高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展
多症。李闪等［４］研究发现软骨发育不全与ＦＧＦＲ３
１ 高分辨熔解曲线分析技术概况
基因Ｇｌｙ３８０Ａｒｇ突变有关，软骨发育不良与ＦＧＦＲ３
Ｕｔａｈ大学的Ｗｉｔｔｗｅｒ实验室和Ｉｄａｈｏ公司在 基因Ａｓｎ５４０Ｌｙｓ突变有关，并针对两组基因突变建
１９９７年首次提出ＰＣＲ联合熔解曲线，由荧光信号 立了ＨＲＭ技术的快速筛查方法。角膜炎－鱼鳞病
监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技 带－３蛋白缺陷，何本进等［３］研究表明高效、准确、
术［１］。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的 低成本的分子诊断方法ＨＲＭ可以对ＳＬＣ４Ａ１基因
各个领域，对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药 进行突变筛查，从而辅助诊断遗传性球形红细胞增
敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。
有快速简便、成本低、灵活性高、敏感性高、特异性 关，叶军等［９］证实了ＭＥＤ１２基因突变与子宫肌瘤
高、闭管操作等优点。
有关，这两种基因突变都可以采用ＨＲＭ技术进行
２ 高分辨熔解曲线分析技术临床应用
检测，可用于高危人群的健康筛查和风险评估，为广
２．１ 遗传病
大妇女同志带来福音。ＨＲＭ技术在非小细胞肺癌
变化实时监控ＰＣＲ产物的技术，随后几年此方法不 －耳聋综合征的ＧＪＢ２基因［５］、原发性肥大性骨关
断改进，经历了ＨＲ－１，ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ和Ｒｏｔｏｒ－ 节病的ＨＰＧＤ基因［６］、原发性局限性皮肤淀粉样变
Ｇｅｎｅ６０００等，期间也不断有其他公司研制出用于 的ＯＳＭＲ基因［７］等都可以采用ＨＲＭ作为筛查方
Ｓｙｔｏ９，ＥｖａＧｒｅｅｎｓ等，不同染料对分析结果影响很 产生严重后果，因此肿瘤患者的早期诊断和治疗就
大，有的染料不适用于杂合子变异检测，有的不适用 显得尤为重要。乳腺癌和子宫肌瘤是困扰女性的两
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
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高分辨率熔解HRM的应用前景
高分辨率熔解HRM的应用前景星期一, 三月1st, 2010 | HRM技术 | 苏州为真生物| 浏览:118摘要：高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、基因分型和甲基化分析等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
其实双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。
分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。
后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。
样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。
当时使用的染料是SYBR® Green I。
然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。
如果要区分SNP，分辨率还不够。
为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。
SYBR Green I就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。
这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。
于是，饱和染料问世了。
为什么称为饱和染料呢？因为它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR。
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线
HRM高分辨率溶解曲线是一种用于分析DNA序列变异的技术。
它通过在PCR反应中加入特异性引物和荧光染料，对PCR产物进行实时监测，从而获得高分辨率的溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以用于检测DNA序列的变异、基因多态性、SNP等。
它不仅可以用于科研领域，还可以应用于临床诊断、生物信息学等领域。
HRM高分辨率溶解曲线的原理是利用PCR产物在变性过程中，双链DNA会逐渐解离成单链DNA，这个过程伴随着温度升高。
当温度升高到一定程度时，引物和模板之间的结合力会减弱，导致引物和模板之间的解离。
这个过程可以通过实时监测PCR产物的荧光信号变化来获得溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线的应用非常广泛，例如在遗传疾病诊断、基因多态性分析、SNP筛查等领域都有应用。
在遗传疾病诊断中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于检测基因突变或缺失，帮助医生更准确地诊断疾病。
在基因多态性分析中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于研究不同人群或种群之间的基因变异情况。
在SNP筛查中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于快速检测大量的SNP位点，帮助研究人员更全面地了解基因变异情况。
总之，HRM高分辨率溶解曲线是一种非常有用的技术，可以用于分析DNA序列变
异、基因多态性、SNP等。
它的应用非常广泛，可以为科研、临床诊断、生物信息学等领域提供有力的支持。
高分辨率溶解曲线HRM
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：∙检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁∙鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变∙基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失∙特定突变、多态性位点的筛选∙外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：∙灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用
HRM 介绍HRM 技术是high-resolution melting analysis 即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM 不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA 配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR 仪（LightCycler® 480 和Rotor-Gene 6000 ）和饱和染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现，HRM 技术的普及使用成为可能。
HRM 应用• SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
• HLA 基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM 特点•高通量：1 次可同时检测10-384 样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000 个正常细胞中1 个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25% ，即100 个正常细胞中至少有25 个突变细胞，测序仅适用手术组织。
•特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性高达100% 。
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。
HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。
实验室检测证明，在PCR反应前或反应后加入饱和dsDNA染料，对HRM分析，效果相同。
在PCR后加入，可闭管进行HRM分析，无需凝胶电泳。
HRM分析，不损伤PCR产物，用于HRM分析的PCR产物仍可用于电泳、胶回收、测序等一系列后续操作。
HRM可应用于核酸突变扫描、基因分型、甲基化检测、短串联重复序列分析、序列匹配和RNA编辑等多方面研究，已越来越受到国内外核酸分子实验室的欢迎和重视。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR反应体系中加入双链DNA饱和荧光染料，在PCR反应之后再花15 分钟，就可以完成96或384个样品的DNA变异扫描。
采用这种方法，当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。
一、HRM分析条件1. 设备PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列，序列中如有一个碱基发生突变，都会改变dsDNA的解链温度。
但是这种变化差异极小，只有零点几摄氏度，HRM技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
HRM应用实验设计及结果分析
HRM分析过程
原始曲线 随着DNA熔解，插入 DNA双链中的染料被 释放，荧光信号骤降
对PCR的扩增子进行加热，温度 从50℃逐渐上升到95℃。扩增子逐 渐解链，到达熔解温度（Tm）时， DNA双链完全分开。
初期，荧光强度很高，随着温度 升高，双链DNA逐渐减少，荧光强 度下降。通过检测器，记录荧光变 化的过程。对数据作图，就生成了 熔解曲线 。
三、反应体系
Component Diluent (Mol. Biol. Grade water) PCR Buffer MgCl2 dNTPs Forward primer Reverse primer SYTO®9 EvaGreen Taq DNA polymerase DNA Template Concentration 1X 1.5 mM 0.2 mM 300 nM 300 nM 1.5 µM 1-2X 1.25 U 3 x 109 copies/µL
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突 变，就会改变DNA链的解链温度。 解链温度差异极小，零点几摄氏度，使用高分辨率的仪器才可以检测。
孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020-0.264℃），孔间温度均一性要达到 0.264 ℃以内才能保证HRM分析结果的准确性。大多数Real Time PCR仪的孔间温度差在 0.3-0.5℃，决定了无法胜任HRM 熔解速率（最低要求：0.1℃/秒） 数据密度（最低要求：10个数据点/℃）
导数图 “速率”曲线的最高 峰是分离速率最大的 点，即等于熔解温度
HRM应用主要基于两种技术的 进步：
• •
双链DNA嵌入型饱和荧光染料如 LC Green 具有精确控温装置和高密度数据 采集的仪器
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
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高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
高分辨率溶解曲线和TEAL-TIME PCR
目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。
今天去给大家讲一下两者之间的区别。
（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。
Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）.两者的采集过程HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。
Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。
（三）.两者的应用HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。
基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。
Real-time：定量及基因分型。
基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。
（四）.基因分型方法的费用HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。
（五）.两者所用的染料HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。
Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。
广州誉维生物科技仪器有限公司上传。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。
其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。
通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。
高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。
这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。
2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。
3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。
荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。
4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。
通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。
5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。
根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。
高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。
在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。
在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。
而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。
除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。
通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。
总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线在战略管理中，高分辨率溶解曲线（High Resolution Melting Curve，HRM）是一项重要的技术，它用于检测DNA样本中的序列变异。
HRM技术通过监测DNA双链解旋和融合的过程中释放的荧光信号，能够快速、准确地分析DNA序列的变异情况。
本文将详细介绍HRM技术的原理、应用以及在人力资源管理中的潜在价值。
一、HRM技术的原理HRM技术基于PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增的基础上，结合特定的荧光染料和曲线分析软件，实现对DNA序列变异的检测和分析。
在PCR扩增过程中，引物与DNA靶标序列结合，通过高温将DNA双链解旋成为两条单链，然后通过降温使引物与DNA靶标序列结合并生成新的双链，这个过程称为融合。
同时，荧光染料会与DNA结合，并放出荧光信号。
在HRM分析中，荧光信号会被连续监测并记录下来。
当DNA序列存在变异时，由于突变的序列结构和碱基成分的改变，其解旋和融合的过程会产生不同的热力学特性，从而导致荧光信号的变化。
通过分析荧光信号曲线的形状、峰值和面积等参数，可以准确地判断DNA序列是否存在变异。
二、HRM技术的应用领域1. 疾病诊断与预测HRM技术可用于检测与疾病相关的基因突变，例如肿瘤标志物、遗传性疾病、感染性疾病等。
与传统的测序方法相比，HRM技术具有快速、高通量、高灵敏度和低成本等优势，因此在疾病诊断与预测方面具有潜在的应用前景。
2. 品种鉴定与遗传分析在农业领域，HRM技术可用于鉴别农作物品种、检测动植物基因突变、分析遗传多样性等。
通过快速、准确地判断DNA序列的差异，可以帮助农业科学家提高品种鉴定的准确性，加速新品种的培育进程。
3. 药物研发与剂量调控HRM技术在药物研发中的应用主要包括药物基因敏感性筛选、药物代谢酶基因多态性检测等。
通过分析患者的基因型和药物反应之间的关系，可以优化药物疗效，减少药物副作用。
高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。
在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。
表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。
Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。
SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。
Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。
高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。
MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。
检测过程需要多点质控，否则精确度很低。
另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。
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• 第二类是酶切。步骤繁琐，费时，检测已 第二类是酶切。步骤繁琐，费时， 知SNP。结果不稳定。 。结果不稳定。 • 第三类方法中包括测序、Pyrosequencing 第三类方法中包括测序、 等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP 等技术。此外还有芯片等技术可用于 分析； 分析；Pyrosequencing技术它既可进行 技术它既可进行 DNA序列分析，又可进行基于序列分析的 序列分析， 序列分析 SNP检测及表观遗传学甲基化的分析以及 检测及表观遗传学甲基化的分析以及 大规模的等位基因频率测定 。
• 条件要求
• 1、高分辨率：扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的 解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果 仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分 辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解 操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最 低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温 度相差0.1°C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C， 这样就无法保证HRM分析结果的准确性。 • 2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和 了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发 生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲 线才有了更高的分辨率。
• 方法
• 在PCR反应前将LC Green饱和荧光染料与 PCR反应体系 混合，然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或 Rotor-Gene 6000仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩 增产物进行变性，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链。 在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双 链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过 照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图， 就生成了熔解曲线 。
• 有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道 有些研究并不需要完全的基因型。 DNA序列是否匹配，例如：组织移植、基因 序列是否匹配， 序列是否匹配 例如：组织移植、 表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 型．表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 需要对HLA进行基因分型．这个主要牵涉到 进行基因分型． 需要对 进行基因分型 这个主要牵涉到HLAA，B，C和DR等几个位点 A，B，C和DR等几个位点．当两个个体的熔解 等几个位点． 曲线完全相同时就说明HLA基因型完全匹配． 基因型完全匹配． 曲线完全相同时就说明 基因型完全匹配
Clinical Chemistry 54:10 1648–1656 (2008）
•
Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮 测序反应中，只加入一种dNTP（脱氧核糖核苷酸） ，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可 以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。 PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反 应中掺入的核苷酸数目成正比
• 突变扫描
• 目前应用 目前应用HRM进行突变扫描的基因有：C进行突变扫描的基因有： 进行突变扫描的基因有 kit、乙酰辅酶 脱酶的中链、原肉毒碱缺乏 脱酶的中链、 、乙酰辅酶A脱酶的中链 症、RET、表皮生长因子受体 、表皮生长因子受体EGFR、K— 、 ras、苯丙氨酸羟化酶、p53、HER2、囊肿 、苯丙氨酸羟化酶、 、 、 性纤维化基因的几个外显子等等． 性纤维化基因的几个外显子等等．
HRM在分子诊断中的应用
• • • • 基因分型 突变扫描 甲基化分析 序列配对
• 基因分型 • 传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购 买价格不菲的探针。HRM分析无需制备探针；有 了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的 熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同 杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。
• HRM新技术的介绍 • 1、未标记探针HRM • 在HMR的基础上发明一种不带荧光标记的探针，由原来 的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与探针 两部分组成的模式。 • 2、弹回探针 • 弹回探针(snapback primer)是在引物末端加一个与靶片段 (snapback primer) 的突变区域互补的尾巴序列，反应体系是不对称 PCR(asymmetric PCR)，带有弹回探针的引物为过剩引 物(excess primer，EP)，另一条引物为限制引物(1imiting primer，LP)。扩增反应前几个循环为双链扩增，15个循 环左右后为单链扩增。熔解曲线区域包括PCR产物区与探 针区，通过对探针区的熔解曲线进行基因分型、突变等分 析
• 甲基化分析 • HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟 蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理， 将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样， 原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲 基化模板的Tm要低。
Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,No.12
Hale Waihona Puke • 序列配对• 目前突变 目前突变/SNP的研究手段大致有三大类， 的研究手段大致有三大类， 的研究手段大致有三大类 • 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如Taqman探 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如 探 针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知SNP， 针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知 ， 昂贵。 昂贵。
HRM
_____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法
• 高分辨率熔解曲线(high resolution melting)是在 实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定 量新技术。 • 常规Real-time PCR利用SYBR Green染料标记 DNA双链，但是SYBR Green是一种大分子即不 饱和染料，不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合 上SYBRGreen，并且嵌合到产物中的染料如果在 扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。 • HRM采用新型的饱和染料如LC Green， SYTO 9 等。不仅没有不饱和染料的缺点，而且更易于检 测单碱基突变、小片段插入或缺失。
HRM主要特点
• 高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的 SNP检测手段： 快速、高通量—LightScanner 5分钟完成96/384孔板的 PCR产物检测， 20000个SNP/天 准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner100%准确性 、特异性（<400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（ 400~1kb） 重复性好—LightScanner重复性100% 费用低—LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB 操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板） 放入仪器内便可，软件自动基因分型
• 原理
• HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与 PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链 位点碱基不同 DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先 值发生变化 后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从 局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就 可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯 合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有 效区分不同SNP位点与不同基因型。
•
THANKS !
• HRM已经在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中 得到应用．人类疾病基因包括球蛋白、囊肿性纤维化、V 因子、凝血素、血色沉着病蛋白、血小板抗原、乳糖分解 酵素和MGMT启动子区域的甲基化．微生物基冈有： hsp65、16s rRNA基因、gyrA等．
• SNP相关研究方法比较： 相关研究方法比较： 相关研究方法比较