基于环介导恒温扩增法快速检测破伤风梭菌

本 试验 设 计 的破 伤 风 梭 茵 恒 温 扩 增 检 测 方 法 具 有 较 高 的灵 敏 度 和 特 异 性 ， 简便 、 速 ， 用 于 破 伤 风 梭 茵现 场 检 验 。 快 适 关 键 词 ： 梭 菌 ， 伤 ； 敏 感性 和 特 异 性 ； 环 介 导 恒 温 扩 增 风 破
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１ ２４ ・ ９
国际检验 医学杂志 ２１ ０１年 １ 月 第 ３ 卷 第 １ Ｏ ２ ７期
Ｉｔ ａ ｄＯ ｔｂｒ ０ １Ｖ １３， ｏ１ ｎ ＬｂＭｅ，ｃｏｅ ２１， ｏ ２Ｎ ．７ Ｊ ．
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论
著 ・
基 于环 介导恒 温 扩 增 法快 速 检测 破伤 风梭 菌
李 蒙 刘 萍 吴佳 燕 ， 晓允 ， ， 蒲 （ 第三 军 医大学新桥 医院 ：． １ 检验 科 ； ． ２ 妇产 科 ， 重庆 ４ ０ ３ ） ０ ０ ７
染的分泌物待测 。
１ ２ 方 法 ．
Hale Waihona Puke Baidu
司 。Ｌ ＭＰ扩 增 操 作 步 骤 ： Ｉ Ａ 向 ＡＭＰ扩 增 反 应 管 加 入 ２ Ｉ 细
菌 Ｄ ＮＡ， ２ ５ Ｌ反 应 液 ， ． Ｉ ｓ Ｄ １ ． １ ０ Ｂ ｔ ＮＡ 聚 合 酶 ， Ｉ 引 物 ４ （ ４ 引物 ：０／ ｌＬ Ｆ Ｐ ８ ｍｏ／ Ｉ １ ￣ ｌＩ ３ 含 种 ８ ， ／ Ｉ ，０ ｍｏ ｌＬ Ｂ Ｐ， ０／ ／ ｍｏ Ｆ ，
对 临 床 救 治 有 重 要 意 义 。 目前 破 伤 风 梭 菌 的检 测 方 法 主 要 有
ｎｓｔ ｉ ｇｎ ， ｍ ｌ ｅｃｓ 列 为 主 （ｅＢｎ ：Ｆ ５８８１， 其 ｕ ｘ ｅｅｃ ｐｅ ｄ 序 ｏｎ ｏ ｔ Ｇ ｎａｋＡ １４２．）在 相 对保守 的 区域 设计 出了 Ｉ 引物 ：
Ｌｉ ｅ ｇ Ｌｉ ｎ ， ｕ Ｊ ａ ａ ， ａ ｙｕ ｎ ， ｕＰｉ ｇ Ｗ ｉ ｙ ｎ Ｐｕ Ｘｉ ｏ ｎ Ｍ
（ ． ｐ ｒｍｅ ｔ ｆ Ｃｌｎ ｃ ｌＬａ ｏ ａｏ ｙ； ． ｐ ｒｍｅ ｔ ｆ Ｏｂｔｔｉｓａ ｄ Ｇｙ ｅ ｏｏ ｙ １ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｉ ｉａ ｂ ｒ ｔｒ ２ Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｓｅｒｃ ｎ ｎ ｃ ｌｇ ｏ ｏ
ｆ ｌ ｗｈｃ ｓｗｉｈｈｇ ｐ ｃｆ ｉ ｎ ｅ ｓｔｖｔ （ ｔ ｈ ｏ ｓ ｅｅｔ ｎ ｌ ｔｏ ｕｌ ｙ． ｉｈｗａ ｔ ｉｈ ｓ ｅｉｉ ｔ ａ ｄ ｓ ｎ ｉｉｉｙ ｗｉ ｔ ｅｌｗｅｔｄ ｔｃｉ ｉ ｆ１× １ ＣＦＵ／ ５“Ｌ） ｆｒｔ ｅ ｄ ｔｃｉｎ ｏ ｃｙ ｈ ｏ ｍｉ ０ ２ ｏ ｈ ｅｅ ｔ ｆ ｏ
Ｆ３： ＣＡ Ｃ ５ ｒ ＡＴＴ ＧＴ Ａ ＧＴ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ ＣＣＧ Ａ Ａ ３ Ａ Ｇ
Ｂ３： Ｇ ＣＣ ＡＴ ５一 Ｔ ＴＴＧ ＡＣＣ ＴＴ Ａ ＡＴ Ｇ ＧＧ Ｔ ３
分 泌 物 涂 片 镜 下 初 检 、 氧 培 养 后 生 化 鉴 定 等 。直 接 涂 片 法 快 厌 速 、 济 ， 易 与其 他 梭 菌 类 混 淆 ， 异 性 和 检 出 率 低 ； 氧 培 经 但 特 厌 养 后 进 行 ＡＰ 鉴 定 为 目前 破 伤 风 梭 菌 检 测 的“ 标 准 ” 但 培 Ｉ 金 ， 养 条件 高 、 时 长 ， 错 过 最佳 治疗 时 间 ， 约 了该 检 测 在 临 床 耗 易 制 的 开展 ， 其 在 战 伤 、 震 救 灾 等 需 要 现 场 快 速 检 测 的 场 合 不 尤 抗 适 用 。本 研 究 针 对 其 现 场 快 速 检 测 需 要 ， 立 基 于 环 介 导 恒 温 建
扩 增 技 术 （ ｏ — ｄ ｔ ｓ ｔｅ ｍａ ａ ｌ ｉ ｔ ｎ Ｌ Ｍ Ｐ 快 速 １ ｐ ｍｅ ｉ ｅ ｉ ｈ ｒ ｌ ｍｐｉ ｃ ｉ ， Ａ ｏ ａ ｄ ｏ ｆａｏ ） 检测破 伤风梭菌的方法 。
１ 资 料 与 方 法
ＦＩ ： Ｐ ５ＬＡ ＧＡ ＧＧ Ｇ ＡＴ Ａ ＣＣＴ ＧＧＧ Ｇ ＣＡ Ｔ ＴＡ Ｔ ＡＡ Ｇ ＧＡ Ａ Ｔ Ａ ＧＣＣ ＴＴＴ ＡＴ ＡＴ Ａ Ａ ＣＴ Ｔ Ａ一 Ｇ ３
菌 痉 挛 毒 素 基 因 序 列 ： Ｊ１ ４２ １ Ａ ８ １９ ． 、 Ｆ ８ ４４ ２ Ｆ ９ ７０ ． 、 Ｊ ９２ ８ １ Ａ ３ ９２ ． 、
ＡＦ１ ４ ８ ５ ８２ ．１、 Ｆ５ ８ ７ Ａ ２ ０９ ．１、 ｌ ７３ ．１、 ６ ４ Ｍ ２ ９ Ｘ０ ２１ ．１、 ４４ ６． Ｘ０ ３ １。
破 伤 风 （ ｔｎ ｓ是 常 和 创 伤 相 关 联 的 一 种 特 异 性 感 染 疾 ｔ ａｕ） ｅ 病 ， 病 原 菌 是 专 性 厌 氧 的 破 伤 风 梭 菌 （ｌｓｒ ｉ ｔｔｎ） 其 ｃ ｔｉ ｕ ｅａｉ。 ｏ ｄ ｍ 该 菌 在 体 内繁 殖 后 会 产 生 外 毒 素 ， 人 体 表 现 出 剧 烈 的 骨 骼 肌 使 抽 搐 ， 者 常 引起 呼 吸麻 痹 ， 致 死 亡 ｌ ］ 除 可能 发 生 在 各 种 重 导 ｌ。
摘 要： 目的 利 用 环 介 导 恒 温 扩 增 技 术 ， 计 快 速检 测破 伤 风 梭 菌 的 方 法 ， 设 以便 对 破 伤 风 梭 菌 感 染 进 行 快 速 检 测 。方 法
（ ） 计 针 对 破 伤 风 梭 茵的 环 介 导 恒 温 扩 增 检 测 方 法 。 （ ） １设 ２ 对破 伤 风 梭 茵 恒 温 扩 增 法进 行 特 异 性 试 验 。 （ ） 破 伤 风 梭 菌 恒 温 扩 ３对 增 法进 行 灵敏 度 试验 。 结 果 （ ） 计 出针 对 破 伤 风 梭 菌 的 恒 温 扩 增 检 测 方 法 。 （ ） 恒 温 扩 增 检 测 方 法 只 扩 增 破 伤 风 梭 菌 １设 ２本 Ｄ ＮＡ， 其他 茵 不 扩 增 ， 示 出 良好 的特 异 性 。 （ ） 恒 温 扩 增 检 测 方 法 的 最低 检 测 限 为 １ １ Ｃ Ｕ／ ５ Ｉ， 对 显 ３本 × ０ Ｆ ２ 灵敏 度 高 。结 论
对 上述 ８ 个基 因序 列 进行 了 比对 ， 以 ｃ ｓ ｉ ｕ ｔ ｉ ｅ ～ 并 ｌ ｔｄ ｍ ｔａ ｔ ｏ ｒｉ ｅ ｎｔａ
创 伤 中污 染 率 更 高 达 ２ ～８ ， 合 需 氧 菌 感 染 时 更 易 于 ５ ０ 混 发 生 ］ 因此 ， 期 检 出 破 伤 风 梭 菌 有 助 于 预 防破 伤 风 发 生 ， 。 早
ＢＩ ：５ ＴＧ Ｇ Ａ Ａ Ｇ ＣＡ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ａ ＡＴ ＴＧＣ Ｇ ＴＧ ＡＴ Ｔ Ｐ 一
ＣＣＴ ＡＡ Ａ ＧＡ Ｔ ＣＡ Ｇ ＴＣＴ ＴＴＡ ＴＣＡ ＴＣＡ一 ３
１２ ２ 细 菌 Ｄ ．． ＮＡ 提 取 细 菌 Ｄ ＮＡ 提 取 试 剂 盒 由 天 根 生 化 科 技 （ 京 ） 限 公 司 生 产 。 取 待 测 菌 液 ０ ５ｍＩ 置 于 Ｅ 北 有 ． Ｐ管
Ｃｌ ｓ ｒｄｉｍ ｅ ａ ． ｎ ｌ ｓｏ Ｔｈ ｏ ｔ ｉ ｕ ｔ ｔ ｎｉＣｏ ｃ ｕ ｉ ｎ ｅ ＬＡ Ｍ Ｐ ｓ ａ ｆＣｌｓ ｒｄｕｍ ｅａ ｉ ｃ ｎｓｒ ｃｅ ｎ ｔ ｉ ｅ ｅ ｒ ｈ，ｈｏ ｄ ｈｇ ｓ ｃｆｃｔ ｎ ｅ ｓｔ ａ ｓ ｙ ｏ ｏ ｔｉｉ ｔ ｔｎ ，ｏ ｔ ｕ ｔ ｄ ｉ ｈ ｓｒ ｓ ａｃ ｓ ｗｅ ｉｈ ｐｅ ｉｉｉｙ ａ ｄ ｓ ｎ ｉｉ ｖｉ ｔ ｗｉｈ ｔ ｄ ａ ａ ｅ ｆｃ ｎ ｅ ｉｎｃ ｎｄ ｆｓ ｅ ｅ ｔｏ ａ ｏ ｄ ｂｅｕｓ ｄ ｆ ｒｔ ｅ ＰＯＣＴ ｆｔ ｅ Ｃｌ ｔｉ ｕ ｔｔ ｎ ｎ ｅ ｔｏ ． ｙ， ｔ ｈｅａ ｖ ｎｔｇ ｓｏ ｏ ｖ ｎｅ ｅａ ａ ｔｄ ｔｃ ｉｎ， ｎｄ ｃ ｕｌ ｅ ｏ ｈ ｏ ｈ ｏｓｒｄｉｍ ｅａ ｉｉ ｆｃ ｉｎ Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ： ｌｓ ｒｄｉ ｃｏ ｔ ｉ ｕｍ ｅ ａ ｉ ｓ ｎｓｔｖ ｔ ｎｄ ｓ ｅ ｉｉｉｙ； ｔｔｎ ； ｅ ｉｉｉｙ ａ ｐ ｃｆｃｔ ｌｏｐ ｍ ｅ ａ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｍ ｐｌｆｃ ｔｏ ｏ ｄｉｔ ｄ ｉｏ ｈｅ ｍ ｌａ ｉｉａ ｉｎ
Ｌａ ｏｒ ｏ ｙ， ｉ ｉ ｏ Ｈ ｏ ｐｉａｌ， ｂ ａｔ ｒ Ｘ ｎｑ ａ ｓ ｔ Ｔｈｒ ｄ ｉｉａｒ ｅ ｃ ｉ Ｍ ｌｔ ｙ Ｍ ｄｉａｌＵｎｉ ｅ ｓｔ ， ｖ ｒ ｉｙ Ｃｈｏ ｇｑ ｎ ４ ００ ｎ ｉ ｇ ０ ３７， Ｃｈｉ ｎａ）
Ａｂｔａ ｔＯｂｅ ｔ ｅ Ｔｏｄ ｓｇ ｔ ｏ ｕ ｉｇ ｌｏ — ｄａｅ ｓ ｔ ｅｍａ ｍ ｐｉｃ ｔ ｎ（ ｓｒ ｃ ： ｊｃｉ ｖ ｅ ｉｎ ａｍｅｈ ｄ， ｓｎ ｏ ｐ ｍｅ ｉｔｄ ｉｏｈ ｒ ｌａ ｌ ｉａｉ ＬＡＭＰ） ｆｒｃｉｉａ ｏｎ— ｆｃ ｒ ｅ ｆ ｏ ，ｏ ｌ ｃｌｐ ｉｔｏ—ａｅ ｔｓ ｎ
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Ｄ ： ０ ３ ６ ／． ｓ ． ６ ３ ４ ３ ． ０ １ １ ． ０ ＯＩ １ ． ９ ９ ｉｉ ｎ １ ７ １ ０ ２ １ ． ７ ０ ５ ｓ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ３ ４ ３ （ Ｏ １ １ ９ ４０ １ ７— ｌ０ ２ １） ７１ ２—３
Ｒａ ｄ ｄ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｏ ｔ ｉ ｉ ｍ ｅ ａ ｉ ｂ ｏ ｐ ｍｅ ａ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｍ ｐｌｆ ｃ ｉ ｎ ａ ｓ ｙ ｐｉ ｅ ｅ ｔ ｏ ｆ Ｃｌ ｓ ｒ ｄ ｕ ｔ ｔ ｎ ｙ ｌ ｏ — ｄｉ ｔ ｄ ｉ ｏ ｈｅ ｍ ｌａ ｉｉ ａｔｏ ｓ ａ
中 ， 照 细 菌 ＤＮ 提 取 试 剂 盒操 作 步 骤 提 取 Ｄ 按 Ａ ＮＡ。
１２ ３ 扩 增 方 法 ．． Ｄ — ＡＭＰ 扩 增 试 剂 盒 购 自 日本 荣 研 公 ＮＡ Ｌ
１ １ 一 般 资 料 收 集 本 院 普 通 外 科 患 者 １ ． ６例 ， 开 放 性 伤 口 有 合 并 感 染 史 。 其 中 男 ９例 ， 龄 １ ～ ４ 年 ７ ８岁 ， 均 ３ 平 １岁 ； ７ 女 例 ， 龄 ｌ ～４ ， 均 ３ 年 ５ ７平 Ｏ岁 。用 无 菌 拭 子 取 患 者 深 部 伤 口 感
创 伤 后 ， 可 能发 生 于 不 洁 条 件 下 分 娩 的产 妇 和 新 生 儿 ， 战 还 在
择 破 伤 风 梭 菌 痉 挛 毒 素 基 因 （ｌ ｔｄｕ ｅ ｎ ｔ ａｕ ｏ ｉ ｃ ｓｒ ｉｍ ｔ ａｉ ｅ ｎ ｓｔｘ ｏ ｉ ｔ ｔ ｎ
ｇ ｎ ） 靶 基 因 ， 计 Ｌ ＭＰ引 物 。ＮＣ Ｉ 索 到 ８个 破 伤 风 梭 ｅｅ为 设 Ａ Ｂ 搜