感染性疾病的分子诊断20110418
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19
第一节 病毒的基因检测
HBV的形态特征
HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个 属特异性的抗原决定簇“a”和至少两 个亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有 少见的q、g、n、x和t等亚型决定簇） 最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内 蒙古等地
12
感染性疾病的分子诊断策略
一般性策略（检出病原体）：
判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 杂交
检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
13
完整性策略：
感染性疾病分子诊断标志物
病原体核酸分子（DNA/RNA） 基因表达产物 代谢物 免疫应答分子 细 胞 免 疫 体 液 免 疫 T T
印迹：Southern/Northern blot Chip：micro-array 测序技术（sequencing）
6
支链DNA技术（branched DNA, bDNA）
bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术 特点：
不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素 少，因此稳定性、重复性高，结果准确。 操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性 为单链，即可进行检测，不需事先纯化 就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水 平检测。 第一代bDNA技术的检测范围3.5×105~5.7×107copies/ml 第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2×105copies/ml
Ｃ基因特异 片段
5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA3’
5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-
258
25
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
1．样本处理（样本处理区） 2．核酸扩增
2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区）
试剂制备
x
标本处理
x
扩增
x
检测
26
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
1．样本处理（样本处理区）
样本100ul（待测血清或血浆，试剂盒中对照品） 0.5ml离心管中→加入100ul DNA提取液1，振荡混 匀 13,000rpm离心10min；吸弃上清[离心时注意固 定离心管方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀] 再加入25ul DNA提取液2，振荡10sec [沉淀需打散、 混匀] 2,000rpm离心10 sec，100℃干浴或沸水浴10min 13,000rpm离心10min，保留上清备用. （如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃）
HBV 检测窗口期 血清学（HBsAg）：56天 PCR：33天 缩短23天（平均6-15天）
23
第一节 病毒的基因检测
HBV 基因分型
HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因 型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基 因型： A型主要存在于白人， B型和C型主要存在于亚洲人群 E型主要存在于西非 F型仅见于中南美洲的土著人 G型和H型很少见 不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流 行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南 以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南 尤其是西北有较高比例的D型
复杂性（多因素）疾病，诸如：肿瘤、心脑血管 疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病 等等
3
中国：引起死亡的主要疾病
89.1%
91.6%
4
基因病的分子诊断
诊断分子（标志物） 核酸 蛋白质 多糖类 代谢物（生物小 分子）
诊断技术
激素 代谢产物
DNA 病毒 双链（非环状） DNA不等长 正链（2/3） 负链
20
第一节 病毒的基因检测
HBV在肝细胞内的复制
传染性HBV 病毒颗粒 传染性HBV 病毒颗粒
DNA 部分双链 聚合酶 DNA 负链DNA
逆转录酶
HBsAg 包膜
cccDNA
A(n) mRNA
包裹后的前 基因 mRNA
每个测试反应体系配制如下表：
试剂 用量 PCR反应液 17.8ul Taq酶 0.2ul UNG 0.03ul
计算好各试剂的用量，加入一适当体积试管中，充分混 合均匀，向设定的n个Roche毛细管中分别加入18ul，转 移至样本处理区
28
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
结果分析条件设定 选F1或F1/F2通道，点击Quantification进入定量分 析窗口； 在Quantification窗口中，设定Analysis方式为Fit points Adjustment方式为Arithmetic；选定Noise band项， 阈值（Noise band cursor）设定以刚好超过正常阴 性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点， 且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际 情况进行调整
Program Cycles Temperat ure (℃) 1 2 3 4
1 1 40 1
37 92 92 60 40
None None None Single None
None None Quantific ation None
2. 3. 2 仪器检测通道选择 选择F1通道
30
第一节 病毒的基因检测
29
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
2. 3 PCR扩增（检测区） 2. 3. 1 循环条件设置
Incubation Time (min:sec) 3:00 1:00 5 30 0 Temperature Transition Rate (℃/sec) 20 20 20 20 20 Acquisiton Mode Analysis Mode
2
单 基 因 病（monogenic diseases）
孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、 血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆 性X综合征等
基因病
获 得 性 基 因 病（acquired genetic disease）
感染性疾病，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等
多 基 因 病（polygentic diseases）
16
第一节 病毒的基因检测
核衣壳 （nucleocapsid）
核酸（nucleic acid）
DNA or RNA
病毒
包膜（envelope） 刺突（spike）
衣壳（capsid）
衣壳粒
蛋白质衣壳
核酸
17
第一节 病毒的基因检测
检测病毒的方法
血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） PCR技术（检出率最高）
分子杂交 PCR 测序 芯片 光谱 色谱 质谱 核磁共振 传感器
5
基因病的分子诊断技术
基于核酸的分子诊断技术 bDNA
PCR
PCR类型：巢式PCR，等温PCR，…… 定性PCR PCR产物 ＋ RE酶切 → 电泳 PCR产物 ＋ RE酶切 → 杂交 定量PCR FQ-PCR（real-time PCR）
7
缺点：
基因病的分子诊断技术
基于蛋白质的分Hale Waihona Puke Baidu诊断技术
ELISA（酶联免疫吸附分析） UPLC Chip HPLC Western blot 2D 电泳 质谱 分离
飞行时间质谱（TOF） LC-Mass，GC-Mass
质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比
8
核磁共振（NMR）
27
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
2．核酸扩增
2.1试剂配置（PCR前准备区） 从试剂盒中提取出HBV PCR反应液、Tap酶及UNG，室 温融化后，2000rpm离心10sec 设所需的管数为n（n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性 对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品）
基因病的分子诊断
Molecular diagnosis for genic diseases
1
基因病概念
1975年，Dulbecco 提出：人类的DNA序列
是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的
发生都与基因直接或间接有关
1978年，Susumu Tinegawa：从人类所有的
疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了 人类疾病新概念——基因病（genic disease）
18
第一节 病毒的基因检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）
世界其它地区
全世界有3.5亿慢性携带者， 75%在亚太地区 每年有一百万人死于HBV感染， 是全球范围内第9位死因 中国：50%~70%的人受过感染，
亚太地区 75%
8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
2. 2 加样（样本处理区）
若样本（及对照品裂解产物）保存在-20℃，使用前置室温 解冻，以13,000rpm离心5min 在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤1中处理过的样 本、阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照上清液以及阳 性参控品各2ul（其中阴性对照做2管），盖紧管盖，连同 Roche专用金属反应管套放在离心机中 于2,000rpm离心5sec 将毛细管排好放入Roche PCR仪内，记录样本摆放顺序
肝细胞
21
第一节 病毒的基因检测
HBV基因组结构
编码 pre-S1
S区 pre-S2
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
S pre-C
C区
C
P区 P X区 X
HBsAg pre-S2
基因重叠
pre-S1 22
第一节 病毒的基因检测
急性感染时期HBV的标志物
基因病的分子诊断技术
基于代谢组学的分子诊断技术
质谱 核磁共振 光谱 色谱
9
第十章
感染性疾病的分子诊断
Molecular diagnosis for infectious diseases
10
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共 生 状 态
人
微 生 物
人
体 微 生 物
体
不 同 的 感 染 状 态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
11
感染后果（转归）
病原体被清除 ------ 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 ------ 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染） ------ 感染致病，慢性感染引起炎症 潜伏性感染 潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体 带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性 携带者 是很多传染病的重要传染源
致敏T细胞 淋巴因子
B
浆细胞
IgM 感染早期出现 IgG 临近恢复期出现 IgA IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
14
感染性疾病的分子诊断临床价值
定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病 毒、细菌和寄生虫感染的诊断 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判 断和病情预后评价提供客观的依据
15
第一节 病毒的基因检测
24
第一节 病毒的基因检测
HBV分子诊断方法
HBV DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特 异片段 Ｃ基因特异 片段 引物序列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC3’ 477 扩增片段大小(bp) 278
第一节 病毒的基因检测
HBV的形态特征
HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个 属特异性的抗原决定簇“a”和至少两 个亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有 少见的q、g、n、x和t等亚型决定簇） 最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内 蒙古等地
12
感染性疾病的分子诊断策略
一般性策略（检出病原体）：
判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 杂交
检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
13
完整性策略：
感染性疾病分子诊断标志物
病原体核酸分子（DNA/RNA） 基因表达产物 代谢物 免疫应答分子 细 胞 免 疫 体 液 免 疫 T T
印迹：Southern/Northern blot Chip：micro-array 测序技术（sequencing）
6
支链DNA技术（branched DNA, bDNA）
bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术 特点：
不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素 少，因此稳定性、重复性高，结果准确。 操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性 为单链，即可进行检测，不需事先纯化 就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水 平检测。 第一代bDNA技术的检测范围3.5×105~5.7×107copies/ml 第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2×105copies/ml
Ｃ基因特异 片段
5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA3’
5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-
258
25
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
1．样本处理（样本处理区） 2．核酸扩增
2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区）
试剂制备
x
标本处理
x
扩增
x
检测
26
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
1．样本处理（样本处理区）
样本100ul（待测血清或血浆，试剂盒中对照品） 0.5ml离心管中→加入100ul DNA提取液1，振荡混 匀 13,000rpm离心10min；吸弃上清[离心时注意固 定离心管方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀] 再加入25ul DNA提取液2，振荡10sec [沉淀需打散、 混匀] 2,000rpm离心10 sec，100℃干浴或沸水浴10min 13,000rpm离心10min，保留上清备用. （如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃）
HBV 检测窗口期 血清学（HBsAg）：56天 PCR：33天 缩短23天（平均6-15天）
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第一节 病毒的基因检测
HBV 基因分型
HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因 型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基 因型： A型主要存在于白人， B型和C型主要存在于亚洲人群 E型主要存在于西非 F型仅见于中南美洲的土著人 G型和H型很少见 不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流 行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南 以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南 尤其是西北有较高比例的D型
复杂性（多因素）疾病，诸如：肿瘤、心脑血管 疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病 等等
3
中国：引起死亡的主要疾病
89.1%
91.6%
4
基因病的分子诊断
诊断分子（标志物） 核酸 蛋白质 多糖类 代谢物（生物小 分子）
诊断技术
激素 代谢产物
DNA 病毒 双链（非环状） DNA不等长 正链（2/3） 负链
20
第一节 病毒的基因检测
HBV在肝细胞内的复制
传染性HBV 病毒颗粒 传染性HBV 病毒颗粒
DNA 部分双链 聚合酶 DNA 负链DNA
逆转录酶
HBsAg 包膜
cccDNA
A(n) mRNA
包裹后的前 基因 mRNA
每个测试反应体系配制如下表：
试剂 用量 PCR反应液 17.8ul Taq酶 0.2ul UNG 0.03ul
计算好各试剂的用量，加入一适当体积试管中，充分混 合均匀，向设定的n个Roche毛细管中分别加入18ul，转 移至样本处理区
28
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
结果分析条件设定 选F1或F1/F2通道，点击Quantification进入定量分 析窗口； 在Quantification窗口中，设定Analysis方式为Fit points Adjustment方式为Arithmetic；选定Noise band项， 阈值（Noise band cursor）设定以刚好超过正常阴 性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点， 且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际 情况进行调整
Program Cycles Temperat ure (℃) 1 2 3 4
1 1 40 1
37 92 92 60 40
None None None Single None
None None Quantific ation None
2. 3. 2 仪器检测通道选择 选择F1通道
30
第一节 病毒的基因检测
29
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
2. 3 PCR扩增（检测区） 2. 3. 1 循环条件设置
Incubation Time (min:sec) 3:00 1:00 5 30 0 Temperature Transition Rate (℃/sec) 20 20 20 20 20 Acquisiton Mode Analysis Mode
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单 基 因 病（monogenic diseases）
孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、 血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆 性X综合征等
基因病
获 得 性 基 因 病（acquired genetic disease）
感染性疾病，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等
多 基 因 病（polygentic diseases）
16
第一节 病毒的基因检测
核衣壳 （nucleocapsid）
核酸（nucleic acid）
DNA or RNA
病毒
包膜（envelope） 刺突（spike）
衣壳（capsid）
衣壳粒
蛋白质衣壳
核酸
17
第一节 病毒的基因检测
检测病毒的方法
血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） PCR技术（检出率最高）
分子杂交 PCR 测序 芯片 光谱 色谱 质谱 核磁共振 传感器
5
基因病的分子诊断技术
基于核酸的分子诊断技术 bDNA
PCR
PCR类型：巢式PCR，等温PCR，…… 定性PCR PCR产物 ＋ RE酶切 → 电泳 PCR产物 ＋ RE酶切 → 杂交 定量PCR FQ-PCR（real-time PCR）
7
缺点：
基因病的分子诊断技术
基于蛋白质的分Hale Waihona Puke Baidu诊断技术
ELISA（酶联免疫吸附分析） UPLC Chip HPLC Western blot 2D 电泳 质谱 分离
飞行时间质谱（TOF） LC-Mass，GC-Mass
质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比
8
核磁共振（NMR）
27
第一节 病毒的基因检测
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
2．核酸扩增
2.1试剂配置（PCR前准备区） 从试剂盒中提取出HBV PCR反应液、Tap酶及UNG，室 温融化后，2000rpm离心10sec 设所需的管数为n（n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性 对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品）
基因病的分子诊断
Molecular diagnosis for genic diseases
1
基因病概念
1975年，Dulbecco 提出：人类的DNA序列
是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的
发生都与基因直接或间接有关
1978年，Susumu Tinegawa：从人类所有的
疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了 人类疾病新概念——基因病（genic disease）
18
第一节 病毒的基因检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）
世界其它地区
全世界有3.5亿慢性携带者， 75%在亚太地区 每年有一百万人死于HBV感染， 是全球范围内第9位死因 中国：50%~70%的人受过感染，
亚太地区 75%
8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
2. 2 加样（样本处理区）
若样本（及对照品裂解产物）保存在-20℃，使用前置室温 解冻，以13,000rpm离心5min 在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤1中处理过的样 本、阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照上清液以及阳 性参控品各2ul（其中阴性对照做2管），盖紧管盖，连同 Roche专用金属反应管套放在离心机中 于2,000rpm离心5sec 将毛细管排好放入Roche PCR仪内，记录样本摆放顺序
肝细胞
21
第一节 病毒的基因检测
HBV基因组结构
编码 pre-S1
S区 pre-S2
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
S pre-C
C区
C
P区 P X区 X
HBsAg pre-S2
基因重叠
pre-S1 22
第一节 病毒的基因检测
急性感染时期HBV的标志物
基因病的分子诊断技术
基于代谢组学的分子诊断技术
质谱 核磁共振 光谱 色谱
9
第十章
感染性疾病的分子诊断
Molecular diagnosis for infectious diseases
10
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共 生 状 态
人
微 生 物
人
体 微 生 物
体
不 同 的 感 染 状 态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
11
感染后果（转归）
病原体被清除 ------ 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 ------ 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染） ------ 感染致病，慢性感染引起炎症 潜伏性感染 潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体 带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性 携带者 是很多传染病的重要传染源
致敏T细胞 淋巴因子
B
浆细胞
IgM 感染早期出现 IgG 临近恢复期出现 IgA IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
14
感染性疾病的分子诊断临床价值
定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病 毒、细菌和寄生虫感染的诊断 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判 断和病情预后评价提供客观的依据
15
第一节 病毒的基因检测
24
第一节 病毒的基因检测
HBV分子诊断方法
HBV DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特 异片段 Ｃ基因特异 片段 引物序列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC3’ 477 扩增片段大小(bp) 278