禽流感诊断方法研究进展讲解

禽流感诊断方法研究进展

摘要：禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A 型流感病毒属中的不同亚型引起的禽类的一种急性高度接触性传染病[1]。由于亚型众多，而且各亚型或血清型之间无交叉反应性，这使得禽流感病毒的检测工作较为困难。实验室传统的诊断方法是病毒分离和血清学方法，病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，其结果准确、可靠、灵敏、极少量病毒也可检出，但操作程序繁杂，检测周期长，需要其它的辅助检测手段。血清学方法如：血凝抑制试验、琼脂扩散试验、神经氨酸酶抑制试验、间接酶联免疫吸附试验等方法较之病毒分离具有更快速、准确、高效的特点，逐渐成为了禽流感确诊的主流手段，但它主要是通过检测禽群体内抗体水平的变化，从而间接了解其体内病原感染情况的变化，具有明显的滞后性，不能适应当前养禽业的要求。当前面对禽流感病毒亚型众多、变异快的现状，人们迫切需要一种更高效的检测技术在更短时间内检测禽群感染情况。分子生物检测技术因其较之传统的检测方法更具有快速、敏感、特异等特点而倍受关注。

关键词：禽流感病毒病原学检测血清学检测分子学检测

1 前言

禽流感( Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的危及禽类、人类和小型哺乳动物的以呼吸道症状为主，甚至全身性败血症的一种疫病，呈世界性发生和流行。根据血凝素(H)和神经氨酸酶(N)，可将 A 型流感病毒分为不同亚型，

已报道有16种血凝素H 亚型 ( H

1-H

16

)和9种神经氨酸酶 N 亚型(N

1

-N

9

)[2]。A 型流感病

毒感染人、猪、马、海豹、水貂、鲸及所有禽类。在正黏病毒科中A 型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。根据致病力的不同可以分为高致病性病毒(High Pathogenic Avian Influenza，HPAI) 和低致病性病毒(low pathogenic avian influenza，LPAI)。高致病性病毒可导致禽类大批死亡，并严重威胁着人类公共卫生安全；低致病性病毒低毒力株能明显降低家禽的生产性能，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新毒株或毒力增强。早在 1878 年，Perroncito[3]就报道了禽流感在意大利的流行。1901年Centanni、Saranuzzi [4]分离和描述了该病的病原，但直到 1995 年Schafer[5]证明该病

属于A型流感病毒。高致病性禽流感通常由H

5和H

7

亚型禽流感病毒引起，是严重危害

养禽业的重大疫病，发病急剧、致病力强，发病率和死亡率可达到100%，能对养禽业造成毁灭性的打击，危害严重，是世界各国重点检疫和防范的对象。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为A类传染病[6]，我国将其列为一类动物疫病。近年来，AI 流行呈上升态势，

还接连不断地发生了H

9N

2

、H

7

N

7

、H

5

N

1

亚型禽流感病毒感染人、致人死亡的事例。世界卫

生组织报告显示，仅2003年至2007年6月25日，世界范围内已报道有315人被感染，191 人死亡，引发了严重的社会公共卫生问题。我国于1979年首次分离到 AIV，1994 年报道AI在鸡群中流行，1996年在广东地区的鹅群中首次分离到 H

5

亚型 AIV。1997年，

我国香港首次发生H

5N

1

亚型 AIV 感染人并致人死亡的事件。据估计损失约达8000 万港

币，这使得H

5

亚型禽流感病毒的公共卫生地位更加突出，在经历SARS之后，人们已认识到了高致病性禽流感潜在的危害性。禽流感被发现100多年来，各国政府都十分重视禽流感的防治研究，我国也有专门的机构研究禽流感。亚型众多是禽流感最显著的生物学特征，再加上基因突变、重组和重排，使其变异极快，导致毒株的致病性也千差万别。而且，不同亚型或血清型之间无交叉反应性或反应性低，这使得禽流感的诊断监测工作较为困难，禽流感诊断方法的研究、开发与应用也越来越受到人们的关注。因此，快速、及时、准确地检测出禽流感对保障国民的生命财产安全具有重要意义。传统的诊断方法与近年来发展起来的分子生物学诊断方法以其不同的特点应用于科学研究和临床诊断。目前在国内外禽流感实验室主要有以下几种不同的诊断方法。

2.病原学检测

2.1病毒的分离鉴定

用9-11日龄的SPF鸡胚分离增殖病毒，一般于24-120h出现死亡，收获尿囊液，此尿囊液即可能含有分离的病毒。一般来说，初次分离的流感病毒具有血凝性，若无血凝性，可盲传3代，若仍然不出现血凝性，则可判断为阴性。有血凝性的病毒可能为流感病毒，可再作进一步的鉴定。分离鉴定的同时，进行致病力试验，确定毒力强弱。病毒的分离鉴定对禽流感的诊断比较确实，该方法具有精确、敏感的优点，但操作繁琐，耗时较长，需要一周左右时间。

2.2 电镜检测技术

由于流感病毒为正粘病毒，属于形态特征性强的病毒，因而可用电镜技术来诊断[7]，为提高禽流感的检出率，除样品制备技术外，取病料的部位和时间也是获得准确检验结果的关键。电镜技术快速、准确，但不能用于亚型及致病性的测定。

3.血清学检测

3.1血凝试验HA和血凝抑制试验HI

AIV 能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。HA加敏法是一种改进的HA试验方法，该法测抗体效价比常规法高2-4倍，若抗原用乙醚裂解，其敏感性比常规法高4-6倍，但观察时以30min内为好，否则易出现假阳性。HI试验时，应先除去非特异性凝集反应。许多禽类血清都含有非特异性血凝抑制因子，能和红细胞表面受体竞争性地作用于病毒表面的血凝素而发生非特异性凝集反应，通常用受体破坏酶即霍乱菌培养液处理法或高碘酸钠法制备血清[8]。

3.2琼脂凝胶扩散试验(Agargel proliferate,AGP)

抗体在琼脂中由高浓度向低浓度自由扩散形成特异性肉眼可见的沉淀线，适用于检测所有A型AIV感染产生的血清抗体，也适用于鉴定AIV。这种方法简单易操作，但敏感性特异较差，易出现假阳性，且不能区分动物血清抗体阳性是病毒感染所致还是注射的