常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
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常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：
（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过
氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤）。