实验十一蛋白质及氨基酸的呈色反应
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实验八 蛋白质的性质实验（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应
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一、实验目的
1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3.学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法
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（一）双缩尿反应
1.实验原理 尿素加热至1800C左右，生成双缩尿并放出一分 子氨。双缩尿在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫 红色化合物，此反应称为双缩尿反应。 蛋白质 分子中含有肽键，其结构与双缩尿相似，也能发 生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定
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2.试剂
（1）尿素 10g (2) 10%氢氧化钠溶液 250 mL (3)1%硫酸铜溶液 60 mL
（4）2%卵清蛋白溶液 80 mL
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3.实验操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿 素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出 氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振 荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉 红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢 氧化铜能掩盖粉红色
3.实验操作
向6个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出 现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火 加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
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管号
材料 （滴）
1
鸡蛋清 溶液
4
2
指甲 少许
3
头发 少许
4
5
6
0.5% 苯酚
4
0.3% 0.3% 色氨酸 酪氨酸ห้องสมุดไป่ตู้
（4）0.1%茚三酮-乙醇溶液 20mL
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3.实验操作
①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀， 在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变 紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风 干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液， 在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
3
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反应式
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5
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双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。 含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，
—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或
—CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等 物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与 Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+。因此，一 切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但 有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成
CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第
二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子
和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸
在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显
9 色。
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2.试剂
（1）蛋白质溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水=1:9) （2）0.5%甘氨酸溶液 80mL （3）0.1%茚三酮水溶液 50mL
4
4
浓硝酸/ （滴）
2
40
40
4
4
4
现象
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%
氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化
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思考题
通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨 基酸的方法?它们的原理?
能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的 存在？
实验总结
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向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶 液2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察 紫玫瑰色的出现
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（二）茚三酮反应
1.实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所 有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫 色物质。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸 水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方 法。
（1）鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用6 层纱布过滤。
（2）头发 （3）指甲
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（5）0.5%苯酚溶液 50mL (6) 浓硝酸 200mL (7) 0.3%色氨酸溶液 10mL (8) 0.3%酪氨酸溶液 10mL (9) 10%氢氧化纳溶液 100mL
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（三）黄色反应
1.实验原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇
硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性 溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄 色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸 才有黄色反应。
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2.试剂
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一、实验目的
1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3.学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法
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（一）双缩尿反应
1.实验原理 尿素加热至1800C左右，生成双缩尿并放出一分 子氨。双缩尿在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫 红色化合物，此反应称为双缩尿反应。 蛋白质 分子中含有肽键，其结构与双缩尿相似，也能发 生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定
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2.试剂
（1）尿素 10g (2) 10%氢氧化钠溶液 250 mL (3)1%硫酸铜溶液 60 mL
（4）2%卵清蛋白溶液 80 mL
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3.实验操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿 素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出 氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振 荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉 红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢 氧化铜能掩盖粉红色
3.实验操作
向6个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出 现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火 加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
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管号
材料 （滴）
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鸡蛋清 溶液
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2
指甲 少许
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头发 少许
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0.5% 苯酚
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0.3% 0.3% 色氨酸 酪氨酸ห้องสมุดไป่ตู้
（4）0.1%茚三酮-乙醇溶液 20mL
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3.实验操作
①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀， 在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变 紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风 干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液， 在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
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反应式
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双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。 含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，
—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或
—CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等 物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与 Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+。因此，一 切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但 有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成
CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第
二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子
和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸
在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显
9 色。
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2.试剂
（1）蛋白质溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水=1:9) （2）0.5%甘氨酸溶液 80mL （3）0.1%茚三酮水溶液 50mL
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浓硝酸/ （滴）
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现象
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%
氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化
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思考题
通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨 基酸的方法?它们的原理?
能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的 存在？
实验总结
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向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶 液2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察 紫玫瑰色的出现
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（二）茚三酮反应
1.实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所 有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫 色物质。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸 水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方 法。
（1）鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用6 层纱布过滤。
（2）头发 （3）指甲
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（5）0.5%苯酚溶液 50mL (6) 浓硝酸 200mL (7) 0.3%色氨酸溶液 10mL (8) 0.3%酪氨酸溶液 10mL (9) 10%氢氧化纳溶液 100mL
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（三）黄色反应
1.实验原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇
硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性 溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄 色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸 才有黄色反应。
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2.试剂