胶体金免疫层析试验须注意的几个问题
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
胶体金免疫层析法生产
胶体金免疫层析法生产
胶体金免疫层析法的生产过程如下：
1.将蛋白质置入透析袋中，然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水
中（0.005mol/l NaCl，pH7.0）进行透析。
2.去除蛋白质中的沉淀。
长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保
存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml的情况下，很容易形成聚合物。
这些聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，在标记之前需要离心以除去这些聚合物。
3.确定最佳pH值。
一般认为，当pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电
点时（pH=PI+0.5pH），蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面。
由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。
如果低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。
以上是胶体金免疫层析法的生产步骤，建议咨询专业人士获取更多信息。
第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
LA T E R A L FLO W T E S T S T R IP O F V E D A LA B
30
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的抗 体1＋标本中待测 抗原＋金标记的 抗体2显色
• 用于测抗原
原 • 是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术 理 • 将结合各的种以反应微试孔剂滤分膜点为固载定体在的测快试速版的相固应相
• 通区膜域过免，毛疫检细分测析管标作技用术本加使在样试品纸溶条 液的 在一 层端析材料 上泳动，样本中的待测物与层析材料中 的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特 定区域（检测线），通过标记抗体显色
§ 最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为 载体的免疫测定技术
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术具有简单、快速、灵敏等特 点，得到了广泛应用
§ 20世纪90年代兴起的胶体金免疫层析技术，特 别是试纸条的发展，使操作更加方便快捷
§ 胶体金标记免疫检测技术在临床医学检测、激 素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速 检测，以及抗原抗体分析等诸多领域迅速发展
食品 食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精
安全 各监管部门
等）,大肠杆菌,黄曲霉素
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
—
瘦 肉 精
克 伦 特 罗
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
—
兽 药
恩 诺 沙 星
致病菌--大肠杆菌O157
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1、1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1、2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1、3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。
胶体金检测技术-
阳性结果 样品中可能含有等于或源自于3ng/ml的盐酸克伦特罗。培训资料
四、ß -激动剂检测卡快速筛查尿样的方法介绍
以盐酸克伦特罗胶体金快速检测卡为例
一．适用范围： 主要用于定性检测，测定动物尿液，如猪尿、牛尿、羊 尿等样品中盐酸克伦特罗的残留。整个检测过程只需要 5~10分钟左右，灵敏度为3 ng/ml(3ppb)。也就是说当 尿液中盐酸克伦特罗的残留大于或等于3 ng/ml时，检测 卡才能检测到。
试纸条中的NC膜受潮后，尿样在上面无法正常泳动，无 法到达吸水纸的位置；胶金垫上的金标抗体受潮后会变性， 从而失去原有的生理性功能，影响抗原抗体的选择性反应。 因此，试纸条必须保持干燥，从包装袋中取出后要尽快使用。 3.检测时，避免阳光直射和电风扇、空调的风直吹
尿样一开始在NC膜上泳动时，是利用毛细管作用，如果 风吹太阳晒，NC膜上的尿样蒸发后难以到达吸水纸的位置，会 产生假阳性结果，因此，检测时要避免阳光直射和电风扇、空 调的风直吹。
培训资料
二 、包装 每个包装袋中包含盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测卡 ，滴管1个、干燥剂1片。
三、现场筛查步骤
1. 在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将检测卡 和待检样本溶液恢复至室温。
2. 从原包装袋中取出检测卡，打开后请在一个小时内就地 使用。
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3．将检测卡平放，用移液器或滴管吸取尿液样品溶液，垂 直滴加3滴（约80ul）于加样孔中，加样后开始计时。
培训资料
图1 金颗粒示意 图
在溶液中金颗粒呈 圆形, 表面带有负电 荷 , 由于静电的排斥 力 , 使其在水中保稳 定状态，形成稳定 的胶体状态。
培训资料 3. 胶体金试纸条的构造
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
免疫层析(金标)产品的不可控性
一、抓不住的胶体金一个看似简单的胶体金的制备过程，其实有相当复杂的控制工艺，稍有偏差，就会导致生产出劣质、性能差及重现性极差的产品进而影响其商业用途。
将这样的产品应用于快速检测中可能导致结果的低稳定性、低敏感性及低特异性。
在胶体金的制备过程中，需要把氯金酸还原成金原子。
加入还原剂之后，溶液中金原子的含量上升并达到过饱和，并在核化过程中发生凝集作用，形成由11个金原子构成的中央的二十面体金核心。
最初形成的核数目决定了最终将有多少颗粒形成于溶液中，还原剂越多产生的晶核越多从而产生的金颗粒也越多。
显而易见，在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点的数目越多，最终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。
因而微粒的大小可通过所加入的还原剂的量来精细调控。
如果溶液中所有的核化位点都可以在瞬间同时发生，所形成的金颗粒大小都完全一致。
要做到这一点（同步核化）是非常困难的，常会发生核化过程的不均一及多分散性胶体的产生，最终导致产品的重复性低下、交联物不稳定。
胶体金及交联物的生产制造表面看似简易，若掉以轻心则如果还原过程中核化作用及形成速度没有得到很好控制，粒子的形成就会不均一。
这样的粒子在与蛋白的结合过程中将无法被均匀包被，也不能在溶液中均匀分布。
仅仅5%形状不均一的粒子都会影响测试的结果，使其完全不具重现性，而这种不稳定性更容易造成错误的结果。
更严重的是，粒子形状及尺寸的不均一会导致蛋白包被的不均一，这样会导致交联物长时间的积聚与凝集，储存于溶液中的交联物可能于几天甚至几个小时内就出现这样的变化。
即使立即将交联物干燥于固相基质上也无法完全克服这个问题，在干燥过程中，由于粒子形状而未稳定结合的表面蛋白很容易分离，造成假阳性及高背景。
这也就是为什么胶体金标记的产品批间差较大（30%）的原因，因为每一批胶体金在制备过程存在天然的不可控性（氧化还原的过程），直接影响到每批胶体金的颗粒大小，颗粒分布比例，颗粒稳定性都不一样。
免疫胶体金法的影响因素
免疫胶体金法的影响因素
免疫胶体金法（Immunochromatographic Assay）是一种常用于
快速、简便、阳性结果可直观观察的免疫分析方法。
其影响因素包括：
1. 样品稀释系数：适当的样品稀释系数能够避免高浓度样品的背景干扰，同时保证所检测物质的有效浓度。
2. 抗原抗体反应性：抗原和抗体的选择和质量对免疫胶体金法的灵敏度和特异性有重要影响。
3. 膜滤纸的选择：膜滤纸是免疫胶体金法的重要组成部分，其表面性质和孔径大小决定了反应物质的传输速率和分离效果。
4. 胶体金颗粒的性质：胶体金颗粒的大小、浓度和稳定性直接影响了免疫胶体金法的灵敏度和稳定性。
5. 反应时间：反应时间的选择直接影响了胶体金颗粒在膜滤纸上的迁移速率和反应的充分性。
6. pH和离子强度：适当的pH和离子强度有助于提高免疫胶
体金法的灵敏度和特异性。
7. 操作技巧：正确操作和使用标准操作程序能够减少人为误差，提高免疫胶体金法的准确性和可重复性。
胶体金免疫层析技术在食品安全现场快速检测中的应用
胶体金免疫层析技术在食品安全现场快速检测中的应用
胶体金免疫层析技术是一种广泛应用于食品安全现场快速检测和生物医学检测中的一
种技术。
其基本原理为利用金纳米颗粒在光的作用下的特殊颜色散射和吸收特性，将其与
特定抗原或抗体结合在一起，进行零点检测，从而达到快速、准确、高灵敏度的检测结
果。
胶体金免疫层析技术主要包括样品浸润、检测剂涂布和读取结果三个步骤。
具体操作
步骤如下：
1. 样品浸润：将待检样品加入相应的稀释液中，使其浓度与检测要求相适应；
2. 检测剂涂布：将样品与特定的抗体或抗原结合的检测试剂涂布在检测纸条上；
3. 读取结果：在检测纸条上读取检测结果，通常是根据纸条颜色的变化判定结果
的。
胶体金免疫层析技术主要适用于病原体、重金属元素、农药、兽药、抗生素等食品安
全检测领域。
例如，在肉制品中被检测到的三联磷等药物残留的检测中，胶体金免疫层析
技术可以实现快速、定性、定量的检测，准确率高、检测时间短。
此外，在海产品、蟹类、鱼类等贝类食品中检测常见的福尔马林、二氧化硫等物质的残留，以往需要一天时间的检
测时间，而应用胶体金免疫层析技术则能将其缩短至1小时以内。
相比于传统的检测方法，胶体金免疫层析技术具有快速、准确、低成本、易操作等优点。
但是，由于技术门槛较高、适用的样品范围有限等因素限制了其在实际应用中的推广。
在今后的食品安全检测中，需要进一步完善胶体金免疫层析技术的性能和准确率，以满足
不同领域和不同样品类型的检测需要。
胶体金法操作注意事项
胶体金法操作注意事项全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：胶体金法是一种将金属离子还原成金属纳米粒子的技术，广泛应用于纳米材料制备、生物医药、传感器等领域。
在进行胶体金法操作时，有一些注意事项需要遵守，以确保实验顺利进行并获得理想的结果。
实验室安全是最重要的一点。
在进行胶体金法操作时，通风良好的实验室环境是必要条件。
操作人员应戴好实验室防护眼镜、手套等防护用具，避免金属离子或其他化学物质对皮肤和眼睛的刺激。
胶体金法操作中需要使用高纯度的试剂。
金属离子溶液、还原剂、稳定剂等试剂应该经过严格的处理和净化，以确保实验的准确性和可重复性。
实验器材也需要经过严格的清洁和消毒处理，避免杂质对实验结果的影响。
实验中需要严格控制反应条件。
胶体金纳米粒子的形貌和粒径大小受到反应条件的影响，如温度、pH值、还原剂浓度等。
操作人员需要根据实验要求精确控制反应条件，避免因条件不当导致实验结果不稳定或无法复制。
实验过程中需要定期监测反应的进行情况。
通过观察反应体系的颜色、浑浊度等变化情况，可以了解反应的进行情况，并及时调整操作步骤。
在操作过程中，遇到异常情况如反应失控、溶液溢出等，应立即停止操作并进行处理，避免事故发生。
实验后需要对产物进行适当的处理和储存。
胶体金纳米粒子具有一定的稳定性，但在长时间保存过程中仍可能发生聚集或变性现象。
操作人员需要选择合适的稳定剂、储存条件等手段，保证产物的质量和活性。
胶体金法是一种有效的制备金纳米材料的方法，但在操作过程中需要遵守一系列注意事项，以确保实验顺利进行并获得理想的结果。
只有严格按照操作规程进行操作，准确控制反应条件，及时监测反应的进行情况，对产物进行适当处理和储存，才能保证实验的成功和产物的质量稳定。
希望以上内容对胶体金法操作有所帮助。
第二篇示例：胶体金法是一种常用的合成纳米材料的方法，其中金纳米颗粒通过还原金盐来制备。
在进行胶体金法操作时，需要遵守一定的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。
“瘦肉精”免疫胶体金试纸条的结构原理和使用注意事项
“瘦肉精”免疫胶体金试纸条的结构原理和使用注意事项陈长木【摘要】央视3．15特别节目《“健美猪”真相》节目播出以后，各地普遍加强了对“瘦肉精”的查验力度。
“瘦肉精”免疫胶体金试纸条作为一种方便、快速且适于现场操作的检测方法，在广大基层检测单位得到了广泛应用。
为了提高广大基层检测人员对免疫胶体金试纸条检测方法的了解，【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】2页(P50-51)【关键词】免疫胶体金;“瘦肉精”;使用注意事项;试纸条;结构原理;检测人员;节目播出;现场操作【作者】陈长木【作者单位】辽宁省动物卫生监督所,辽宁沈阳110015【正文语种】中文【中图分类】S851.34央视3.15特别节目《“健美猪”真相》节目播出以后，各地普遍加强了对“瘦肉精”的查验力度。
“瘦肉精”免疫胶体金试纸条作为一种方便、快速且适于现场操作的检测方法，在广大基层检测单位得到了广泛应用。
为了提高广大基层检测人员对免疫胶体金试纸条检测方法的了解，本文拟对免疫胶体金试纸条结构、原理和在其使用过程中的注意事项进行阐述，以期能够对“瘦肉精”的检测工作起到帮助作用。
1 免疫胶体金试纸条的结构1.1 外部结构成型的商品化试纸条多数是带有塑料外壳的长方形卡片状。
外壳上一般能看到一个圆形或椭圆形加样孔和一个长方形的观测孔。
加样孔一般设计成一个漏斗型，其目的是为了增加一次的加样量，同时也有利于样品的均衡吸收。
观测孔一侧会标记大写的字母C和T，分别是“Contrl”和“Test”的首字母，其中T字母靠近加样孔，C字母远离加样孔。
在胶体金检测中一般用字母C标示质控线，T 标示检测线。
质控线就是判断试纸条本身是否失效，或者试验操作是否有误的一个前提；检测线则是判断结果为阴性还是阳性的依据。
总之，胶体金试纸条外壳就是胶体金试纸卡的支架和“显示窗”。
1.2 内部结构拆开胶体金试纸卡的外壳，可以看到胶体金试纸条内部是个小纸片样的结构。
实验六 胶体金免疫层析技术[课资借鉴]
![实验六 胶体金免疫层析技术[课资借鉴]](https://img.taocdn.com/s3/m/91ec2a306bec0975f565e251.png)
行业倾力
14
行业倾力
H5亚型AIV尿 囊液阳性结果
阴性对照
H5ＡIV细胞 毒阳性结果 阴性对照
15
课后思考
1. 瘦肉精试纸条检测的原理？ 2. 早孕试纸条检测的原理？
行业倾力
16
胶体金试纸条诊断技术
肖书奇
动物医学院预防兽医学系
电话：18700928448
E-mail: shqxiao术的原理、使用方 法及结果的判定
行业倾力
2
简介
胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析 技术研制而成，该技术是90年代初在免疫 渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的 免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性 腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表 面抗原（HBsAg）等检测。
检测线
硝酸纤维素膜
行业倾力
8
测定
测定时将试纸条下端浸入液体标 本中，下端吸水材料即吸取液体 向上端移动，流经C处时使干片 上的免疫金复合物复溶，并带动 其向膜条渗移。
行业倾力
9
测定
若标本中有待测特异抗原，即可 与免疫金复合物中的抗体结合， 此抗原抗体复合物流至测试区即 被固相抗体捕获，在膜上显出红 色反应线条（T）。
粒为球形，大小均一，无棱角。 ✓质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，
形状各异。
行业倾力
5
简介
胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶 体 金 标 记 技 术 （ Immunogold labeling technique）是以胶体金作为示踪标记物应用 于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
最常用的是双抗夹心法检测抗原检测线质检线吸收垫样品垫硝酸纤维素膜连接垫胶体金垫底板测定时将试纸条下端浸入液体标本中下端吸水材料即吸取液体向上端移动流经c处时使干片上的免疫金复合物复溶并带动若标本中有待测特异抗原即可与免疫金复合物中的抗体结合此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获在膜上显出红色反应线条t
IVD质量管理系列の技术篇胶体金免疫层析法（上）
IVD质量管理系列の技术篇胶体金免疫层析法（上）导读：（点击查看）1.IVD质量管理系列分享の开篇2.IVD质量管理系列分享の技术篇免疫学知识（上）3.IVD质量管理系列分享の技术篇免疫学知识（下）4.IVD质量管理系列分享の技术篇酶联免疫分析法（上）5.IVD质量管理系列分享の技术篇酶联免疫分析法（下）一、概述：本篇主要介绍基于硝酸纤维素膜为载体，以胶体金颗粒为标记物的侧向免疫层析方法。
该方法的基本反应原理与前述的酶联免疫法反应原理一致，目前基于侧向层析技术平台的产品，是发展最为迅速、技术最成熟并得到市场广泛应用的一类POCT产品。
在本篇中介绍的胶体金技术平台分为三部分：胶体金溶液制备及影响因素探讨、胶体金试剂条（卡）制备、关键原辅料的质量控制。
目前的类似产品有荧光免疫层析法、乳胶免疫层析法，因此读者可以代入自己熟悉的领域去理解和掌握本篇所介绍的技术知识，并恳请予以批评指正。
二、胶体金溶液制备及影响因素探讨：1. 胶体金试剂的组成结构（条式、卡式），如下图所示：整个试剂条被贴于PVC底板上，由左至右分别是样本垫、金标垫、NC膜、吸水垫，如果装配成试剂卡，则将试剂条装入右侧的卡壳中，因此整个试纸条的制备包含以下基本过程：1.胶体金颗粒的制备及质量控制；2.金标记物的制备及质量控制；3.金标垫的制备；4.NC膜的制备；5.样本垫的制备；6.试纸条（卡）的装配；2. 胶体金溶液制备：2.1 制备方法概述：许多化学方法都可用于制备单分散体系的胶体金，但目前只有3种方法最为常用，而且所得金颗粒大小可控。
这3种方法都是用还原剂将1%氯金酸水溶液还原，制备出球状金粒。
通常还原剂的还原力越强，浓度越高，所得分散系中的金颗粒直径则越小（表2）。
大颗粒胶体金可用柠檬酸三钠还原氯金酸溶液反应制得，根据还原剂柠檬酸三钠的用量不同，所得颗粒粒径一般在15~150nm范围。
6~15nm的中等粒径金可用抗坏血酸钠还原氯金酸制得，这种方法制得的金粒平均粒径在12nm左右。
胶体金免疫层析试验须注意的几个问题
胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。
此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。
目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。
1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。
胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。
层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。
而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。
其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。
目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。
胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。
1 胶体金颗粒大小的选择胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。
我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。
各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。
由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。
胶体金使用问答
食品安全快速检测试剂盒1、问：食品安全速检测试纸的优势是什么？答：1、检测速度快、且具有一定的灵敏度和转移性2、结构简单、携带方便，非常适合现场快速检测3、操作简单，使用者不需专门培训就能掌握4、价格便宜，不需要检修维护，一次性使用。
目前试纸法已广泛应用于食品、水质、医疗卫生等各个领域。
2、问：食品安全快速检测试剂盒的检测方法是什么？答：食品安全快速检测试剂盒采用的检测方法来源于国际法、教科书中经典的分析方法以及最新的科研成果，并结合现场条件进行简化和改良。
检测的灵敏度、稳定性、可靠性均达到食品卫生评价标准的要求。
已研发出包括甲醛速测试剂盒、二氧化硫速测试剂盒、亚硝酸盐速测试剂盒、蛋白质速测试剂盒、苏丹红速测试剂盒等在内的60多种速测试剂盒。
5、问：胶体金检测卡的优势是什么？答：1、方便快速、所有反应能在15分钟内完成2、成本低、不需要特殊的仪器设备3、应用范围广，可适应多种检测条件4、准确、假阳性率低5、标记物稳定，标记样品在4℃贮存一年以上，无信号衰减现象。
6、胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，对人体无毒害。
一般企业会用自己检测与外部有资质的结构测试相结合，因为样品数量巨大，如果均外部测试，意识费用非常高，二是送样、检测、获得结果的周期长，效率低，无法满足实际应用的需求，所以自检也是顺应企业高效节约的宗旨，对自己用检测出值得怀疑的样本再送检测机构检测ELISA 试剂盒常见问题ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。
1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。
因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。
胶体金快捷免疫诊断技巧
管会在其表面留下印痕.划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导 致假阳性。
干燥
■干燥方法的比较
37度干燥４h：颗粒感较强，易中间白，周边深; 低温真空干燥３h：颜色均一，只是两端稍浅，有一定的柔性。
试纸条组装
■ 在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在 PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜 上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶 体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板 切成4 mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完 成产品的组装。
径粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15
胶体金的鉴定
1. 肉眼观察：在日光下仔细观察胶体金颜色，可以大致估计 金颗粒大小。同时良好的胶体金应该是清澈透明的，若浑 浊或有漂浮物提示有较多的凝集颗粒。
2. 分光光度计扫描吸收峰时光波长来估计金颗粒的大小。
3. 电镜可见精确测定金颗粒的大小。
2. 用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略 偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于 蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
■ 蛋白质最适用量测定:
■ 将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后， 分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质 的对照管，5分钟后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置 2小时。
胶体金免疫层析诊断试纸研发技术服务要求
胶体金免疫层析诊断试纸研发技术服务要求一、服务内容1、4个重组蛋白的大量表达和纯化制备：用于胶体金免疫层析诊断试纸成品制备（5mg/支，纯度＞85%）2、确定优势蛋白：从4个重组蛋白中筛选出适用于胶体金免疫层析优势蛋白。
3、卡式胶体金免疫层析诊断试纸成品制备：用被筛选出的一个或多个胶体金标记的重组蛋白作为原料，制备1种卡式胶体金免疫层析诊断试纸成品。
二、服务要求通过胶体金免疫层析方式，确定纯化重组蛋白抗原最佳工作浓度，达到抗原抗体的最佳结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体反应情况。
1、实验过程要求在温湿度恒定的，十万级洁净环境下操作完成。
2、提供最终的实验报告。
3、在收到每批原料样品后，30个工作日内完成项目内容。
4、要求操作人员经过严格的培训和评估并且有严格的流程管理，且操作经验有5年以上的项目研发经验。
5、实验过程概括（1）重组蛋白的小量表达验证（2）重组蛋白的大量表达纯化（3）抗原抗体结合验证-ELISA法（4）胶体金的制作（5）胶体金标记重组蛋白的制备（6）抗原抗体结合验证-胶体金法（7）胶体金免疫层析诊断试纸的梯度实验筛选最佳匹配条件（8）实际样品检测确认（9）组装生产6、甲乙双方在本项目的研发中需注意保密约定,不得泄漏或提供任何项目情况给第三方。
7、实验项目成功与否受多种条件制约，若试验不成功，乙方应做两次免费验证（针对此项目，其它项目正常收取费用）。
（三）验收标准提供成品试纸400份，试纸规格：60mm*3mm/每份。
包装形式为卡式，铝箔袋干燥密封封装。
买方抽检10份试剂条，对试剂条的检测清晰度、检测重复性、稳定性进行检测。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常有影响要素剖析自胶体金作为特别标记物进行研究以来 ,成立的各样免疫胶体金技术以其特异性强、敏捷度高、操作简捷等特色 ,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被宽泛应用。
免疫胶体金技术的反响过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动向联合的反响过程 ,在这个过程中每个环节的利害都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又遇到好多要素的影响和限制 ,下边将影响免疫胶体金技术的要素作一剖析 ,为成功制备胶体金检测产品供给参照。
1耗材的选择1.1 不一样型号膜的挑选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要 ,作为反响载体影响到整个试验的成败。
不一样的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的根源、种类和数目均大不同样 ,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和散布构造不一样。
膜孔径减小 ,膜的实质可用表面积递加 ,膜联合蛋白的量也递加 ;膜孔径越小 ,层析速度也越慢 ,金标复合物经过 T 线的时间就越长,反响也就越充分 ;所以膜孔径越小敏捷度越高 ,可是同时也减慢了跑板速度 ,增添了非特异性联合的时机 ,也就是假阳性越高。
用于金标免疫迅速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素 / 醋酸纤维素混淆膜 ,不一样的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应依据蛋白质的性质选择适合孔径大小和散布构造的膜 ,找到适合的均衡点 ,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最正确。
1.2 联合垫的选择。
联合垫位于层析系统的中间 ,一般要求联合垫的网格均一且非特异性吸附低 ,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品 ,而不被吸附 ;玻璃纤维素膜具备以上长处 ,同时拥有必定的硬度 ,为试验中常用。
1.3 样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应依据试纸条检测样品的性质选择适合的样品垫和吸水纸 ,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或许改变样品的性质。
胶体金免疫层析试验注意事项
胶体金免疫层析试验注意事项胶体金免疫层析试验，这东西就像一场微观世界里的小竞赛，想要顺利完成它，可得多留几个心眼儿。
做这个试验，样本的采集那是相当重要的。
就好比你要做一道好菜，食材得新鲜优质才行。
如果是采集血液样本，扎针的手法得稳准狠。
可别像新手厨师切菜，哆哆嗦嗦的。
采血的时候，消毒要彻底，不然就像做菜不洗干净食材，容易混进杂质，影响试验结果。
要是采集的是其他样本，比如尿液或者唾液，也得保证样本的纯净度，不能被其他东西污染了。
试验的环境也不能马虎。
这就像运动员比赛得有个合适的场地一样。
温度和湿度都得合适，温度太高或者太低，胶体金可能就不听话了。
就像人在过热或者过冷的环境里会没精神一样，胶体金在不合适的温度下活性也会受影响。
湿度太大，那些检测试纸可能就受潮了，就像饼干受潮变得软趴趴的，检测结果就不准了。
检测试纸的保存也是个大问题。
把它想象成珍贵的茶叶，得好好保存。
要放在干燥、阴凉的地方，避免阳光直射。
要是把检测试纸放在大太阳底下晒着，那就和把茶叶放在烤箱里一样，试纸的性能肯定大打折扣。
而且打开包装之后，要尽快使用，不能让它在外面暴露太久，就像打开的零食要尽快吃完，不然就容易变质。
在进行试验操作的时候，操作手法要规范。
这就跟绣花似的，一针一线都得讲究。
加样的时候，量得准确，不能多也不能少。
多了就像煮汤的时候水放太多，味道都淡了，结果就不准确了。
少了呢，又像炒菜盐放少了，没味道，也得不出正确的结果。
滴加样本的时候，要垂直滴加，可不能歪着滴，不然就像倒水的时候歪着杯子，水会洒出来一样，样本滴加不均匀，也会影响检测。
判读结果的时候，那可不能心急。
要按照规定的时间去看结果，不能提前也不能推后。
提前看结果就像菜还没煮熟就急着吃，肯定不对。
推后看结果呢，就像饭都放凉了才吃，也不是原本的味道了。
而且判读的时候要仔细，要清楚知道什么样的条带是阳性，什么样的是阴性，就像认识不同的水果一样，苹果是苹果，香蕉是香蕉，不能混淆。