第5章 常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析

夹心法反应演示
阳性
阴性
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©②间接法检测抗体
间接法反应演示
阳性
阴性
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©③间接竞争法
竞争抑制法反应演示
阴性
弱阳性
阳性
检测线颜色强度与样品浓度负相关
竞争法结果判断
（三）胶体金免疫测定技术
ª 2.胶体金免疫层析试纸条制作 § （1）试剂、耗材准备 § （2）金标抗体的制备 § （3）试纸条的组装 § （4）试纸条的优化 § （5）样品检测及分析
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （1）试剂、耗材准备
• 硝酸纤维素膜的参数：孔径、对称性、层析速度、表面 活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均 一性等
• um 指的是膜孔径，但膜在生产过程中，由于干燥成型 等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的，不同厂 家膜孔径标准无法统一衡量
（三）胶体金免疫测定技术
ª 1.主要形式（基本原理） § 斑点金免疫渗滤/dot immunogold filtration
assay, DIGFA § 胶体金免疫层析/immunochromatography assay,
ICA--试纸条
（三）胶体金免疫测定技术
§ （1）斑点金免疫渗滤
原 • 以硝酸纤维素膜作为固相载体、包被抗 理 原或抗体
（二）胶体金的制备
® 一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣 酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等
ª 以柠檬酸三钠还原法为例 § 取0.01% HAuCl4 溶液100 mL 搅拌、加热、回
流，沸腾2 min, 迅速一次加入一定量的 1% 柠 檬酸三钠水溶液（现配），保持低沸，经由蓝、 灰、至呈现透明的橙红色停止加热。回流冷却至 室温（应为原体积，否则应用蒸馏水恢复体积） § 加入柠檬酸钠的量不同，胶体金颗粒大小不同
常见免疫学检测技术之
胶体金标记免疫检测
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术创于20世纪70年代，是以胶体 金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体 反应的一种新型免疫标记技术
§ 由于胶体金具有肉眼可观测的红色，所以既可 用于免疫电镜、光镜检测，又能作为指示物结 合固相载体用于体外免疫检测抗原或抗体
在 40-60nm 为好。颗粒再大则变为黑色，且不 稳定；颗粒过小，虽然稳定性好，但颜色为橙黄 色，视觉效果不好，而且小颗粒相对要结合更多 的抗体，系统的灵敏度也随之下降。胶体金溶液 应清亮透明
20nm
制备好的胶体金溶胶
（二）胶体金的制备
ª 胶体金颗粒的鉴定 § 胶体金颗粒的直径符合要求、大小均一、稳定
• 利用微孔滤膜渗滤特性可使抗原或抗 体与膜表面的固相抗体或抗原结合、 聚集，形成紫红色斑点
• 微孔滤膜渗滤特性可完成洗涤过程， 实现游离标记物的分离；
（三）胶体金免疫测定技术
§ （1）斑点金免疫渗滤
胶体金免疫渗滤试验
§ （1）斑点金免疫渗滤
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的多克隆抗体＋标本中待测抗原＋ 金标记的特异性单克隆抗体显色
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （1）试剂、耗材准备
• 硝酸纤维素膜又称为NC膜，在胶体金试纸中用做C/T线 的承载体，同时也是免疫反应的发生处
• 现在有销售的NC膜品牌型号如下： MILLIPORE（美国），M135（有背衬/无背衬两种） M180（有背衬/无背衬两种） WHATMAN and S&S，Puraband impuraband, SARTORIUS（德国），CN140 MDI（印度），8um 6um 伊能（国产），8um 6um
原 • 是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术 理 • 将结合各的种以反应微试孔剂滤分膜点为固载定体在的测快试速版的相固应相
• 通区膜域过免，毛疫检细分测析管标作技用术本加使在样试品纸溶条 液的 在一 层端析材料 上泳动，样本中的待测物与层析材料中 的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特 定区域（检测线），通过标记抗体显色
• 而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是 ***s。该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一 个通用的比较标准
• 换算情况大致为：8um=135s；6um=180s
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （2）金标抗体的制备 • ①抗体的预处理 ² 抗体均应纯化 ²抗体应先对低离子强度的水（5mM NaCl溶液，
食品 食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精
安全 各监管部门
等）,大肠杆菌,黄曲霉素
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
--
瘦 肉 精
沙 丁 胺 醇
—
瘦 肉 精
克 伦 特 罗
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
—
兽 药
恩 诺 沙 星
致病菌--大肠杆菌O157
其它有害物质—三聚氰胺
§ 最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为 载体的免疫测定技术
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术具有简单、快速、灵敏等特 点，得到了广泛应用
§ 20世纪90年代兴起的胶体金免疫层析技术，特 别是试纸条的发展，使操作更加方便快捷
§ 胶体金标记免疫检测技术在临床医学检测、激 素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速 检测，以及抗原抗体分析等诸多领域迅速发展
传染病（乙肝五项,HIV, SARS 等）；标志物（AFP、肌钙蛋 白、粪便血红蛋白等）；女性妊 娠（hCG(早孕),LH,FSH)；毒品 （吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）
农牧 畜牧兽医站, 商检 传染病（禽流感,兽瘟疫等） 业 系统,边检口岸,农
牧类院系和研究所
环境 环保监测部门,研 有害物质超标 究机构
无自凝现象 § 要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油
或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗 粒直径的变异系数（CV）可小于15% § TEM观察，测量100个胶体金颗粒，计算胶体金 颗粒的平均直径及标准差
（二）胶体金的制备
ª 胶体金的保存 § 胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素
不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生 凝聚 § 影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温 度等 § 如需长期保存，可加入 0.02% NaN3，放入4℃ 避光保存
• 可单份检测：对标本既能成批检测，又可 单份检测，可立刻拿到结果，不必等待
• 稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存
• 检测标本种类多：既可用于查血，又可用 于检尿或唾液，因而适合各种检查
类别
应用领域
检测的物质
人类 医学
各级医院,血 站,CDC,防疫站,诊 断中心；家庭自 检；商检系统；边 检口岸；公安系统
² 是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的 包被过程
² 吸附机理可能是胶 体金颗粒表面负电 荷，与蛋白质的正 电荷基团因静电吸 附而形成牢固结合
² 胶体金颗粒与蛋白质的结合不被 坏蛋白质的生物活性，形成胶体 金标记蛋白
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （2）金标抗体的制备
• 用于测抗原
胶体金免疫渗滤试验
§ （1）斑点金免疫渗滤 • 双抗体夹心法原理
A
B
胶体金免疫渗滤试验
§ （1）斑点金免疫渗滤
©②间接法
• 固定于膜上的特异性抗原＋标本中的相应抗体 ＋金标记的抗抗体或金标记的葡萄球菌A蛋白 质（SPA）显色。
• 用于检测抗体 • 图略
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
AuC12- 的zeta 电位可以使胶 体金颗粒之间 相互排斥，以 维持胶体金的 稳定状态
AuC12-
11个金原子
H+
构成的核心
胶体金颗粒结构及带电情况
（一）胶体金的特性
§ 胶体特性 均一的胶体溶液 胶体金呈球形(小颗粒)或椭圆形(大颗粒)
§ 呈色性 颗粒大小不同、颜色不同
§ 特定的吸收光谱 § 胶体金颗粒显负电
• ③最佳标记量的确定
²将待标记的蛋白用5mM NaCl，pH7.0溶液作系 列稀释后，分别取0.1mL（含蛋白质5～40ug） 加到1mL胶体金溶液的EP管中，另设一管不加 蛋白质的对照管；5min后加入0.1mL 10%NaCl 溶液
² 目测：混匀后静置2小时观察 ² OD值作曲线法确定：混匀后10min测
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
LA T E R A L FLO W T E S T S T R IP O F V E D A LA B
30
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的抗 体1＋标本中待测 抗原＋金标记的 抗体2显色
• 用于测抗原
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （2）金标抗体的制备
• 目测法
以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用 量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作 中，可适当增加10％，在此情况下蛋白质分子在金 颗粒表面的吸附量最大
pH7.0）透析，去除盐类成份（盐类能影响金 溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉） ² 应避免磷酸根离子和硼酸根离子，因其可吸附 于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附 ² 高速离心或微孔滤膜除去聚合物
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （2）金标抗体的制备
• ②抗体的标记原理
还原胶10体0 m金L 标0.0记1%物H的AuC制l4备所需量
胶体金粒径 1%柠檬酸钠加入量 Nhomakorabea胶体金特性
（nm) 16 24.5 41 71.5
（ml)* 2.00 1.50 1.00 0.70
呈色 橙色 橙红色 红色 紫色
max(nm) 518 522 525 535
（二）胶体金的制备
ª 胶体金粒径的大小 § 一般来讲，作为免疫检测试剂所用的胶体金颗粒
其它有害物质—三聚氰胺
其它有害物质—孔雀石绿
二、胶体金的特性及制备
§ 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂作 用下，形成的一定大小的金颗粒，成形成带负电 的疏水胶溶液
§ 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au，11个金 原子构成）及包围在外的双离子层构成，紧连在 金核表面的是内层负离子（AuC12-），外层离子 层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离 于溶胶间的悬液状态
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （2）金标抗体的制备
• 目测法
12 34567
胶体金(ml) 1 1
11111
蛋白质(ug) 0 10 15 20 25 30 35
10%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
结果判断: 对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝 的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金 保持红色不变
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （1）试剂、耗材准备
• 氯金酸易潮解，应干燥、避光保存 • 氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶
液时，不应使用金属药匙称量氯金酸 • 用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或
者是高质量的去离子水 • 用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应
• 10 mM PB pH7.4：10mL 200 mM pH7.4 PB加水至 200mL，0.22µm过滤
• 0.2 mol/L K2CO3：5.5284 g 无水K2CO3 定容至 200mL，0.22µm过滤
• 10% NaCl：20g NaCl 加水至200 mL，0.22µm过滤 • 玻璃纤维预处理液 • 硝酸纤维素膜封闭液
胶体金试纸条技术优势:简单\现场\快速
1.打开包装 取出试纸条
2.直接插入 待测样品中
3. 目测读出结果 （3-10分钟内）
试纸条技术的优点
缺点
• 快速：全部检测过程仅需 3-10分钟
定量问题
• 简便：不需其它任何仪器设备，操作也极 其简单，无需专业人员，携带方便，可随 时随地进行
灵敏度问题
• 廉价：单个测试条成本极低
先经酸洗并用蒸馏水冲净。经硅化处理，用5％二氯二 甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，室温干燥后蒸馏水冲 洗，再干燥备用
ª 2.胶体金（免三疫）层胶析体试金纸免条疫制作测定技术
§ （1）试剂、耗材准备
• 5 mM NaCl pH7.4：0.05844g NaCl加水100mL，调 pH7.4，加水至200 mL，0.22µm过滤