大鼠原代心肌细胞培养实验
原代心肌细胞培养技巧【转】
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH 上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。
新生大鼠心肌细胞的原代培养_马芳芳
·康复论著·新生大鼠心肌细胞的原代培养作者单位:1.福建医科大学省立临床学院,福建福州 350001;2.福建省心血管病重点实验室马芳芳1,沈晓丽1,林立芳2,韩莉莉2摘要:目的:探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。
方法:应用0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第2d 乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含10%胎牛血清的DM EM 培养基中和,用差速贴壁分离法分离,在以溴脱氧尿嘧啶(Brdu )纯化心肌细胞后置CO 2培养箱孵育7d 。
结果:分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个,且有活力心肌细胞占90%以上;培养4～6h 的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12～24h 明显增殖,3～4d 后细胞融合成片;心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形,并出现自发性节律性搏动。
结论:本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。
关键词:心肌;细胞培养技术;大鼠文章编号:1008-0074(2009)02-0125-04中图分类号:Q95209文献标识码:APrimary culture of neonate rattus cardiocyte /MA Fang -fang ,SHEN Xiao -li ,LIN Li -fang ,HAN Li -li //C hinese Journalof C ardiovascular Rehabilitation Medicine ,2009,18(2):125A bstract :Objective :T o explo re the prima ry cultures method of neo na ta l ra t car dio myo cy tes .Methods :Car diac mus -cle o f tw o -day neo na te rattus was digested repeatedly by 0.0625%try psin .T he cardio cy tes we re collected in DM EMmedium ,which contains 10%fetal bovine serum .M y ocardial cells we re isola ted with the technique o f differ ential an -choring v elo city with 90min and wer e pured by Brdu .The cardiocy tes w ere placed into CO 2incubato r to incubate sev -en day s after their purificatio n .Results :A to ta l of 1.4million cardiocy tes can be o btained fr om o ne rat and the vitalcell w as ove r 90%;Ca rdiocy te s began to adhere and g row after 4～6h ,to o bv iously pr olifera tion af te r 12～24h ,and to conve rge to gether af te r3～4day s .T he ca rdiocy tes showed spherical ,fusifo rm and poly g on shape in the visualfield of inv erted micro sco pe .A ll cells stretched o ut parapodium and bea ted spontaneo usly and rhythmically .C onclu -sion :A g rea t qua ntity and hig h sur viv al rate cardiocy te s can be effectiv ely a nd quickly cultured by this me thod .Author ′s address :Fujian P ro vincial Ho spital ,Fujian M edical U niver sity ,F uzhou ,Fujian ,350001,ChinaKey words :M y ocardium ;Cell culture techniques ;Rat 自1960年Haracy 等[1]首次对乳鼠的心肌细胞进行培养以来,国内、外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究。
新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定
网络出版时间： 2013-9-25 18： 33
Culture and identification of cardiomyocytes in neonatal rats
HU Bao-kui，GENG Zhao-hua，ZHU Shan-jun，LIU Yu-feng （ Department of Cardiology，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037， China）
在消化过程中，注意控制适宜的温度，在 37℃ 酶的活性较高，能获得很好的消化效果。每次消化 时间应控制在 10 min 以内，以避免长时间消化酶对 细胞的损伤作用。避免产生气泡，因为气泡表面的 张力作用可牵拉损伤细胞。用吸管反复吹打，使细 胞脱落，可缩短消化时间。
心肌细胞和成纤维细胞在培养板中的贴壁速度 不同，成纤维细胞比心肌细胞更容易贴壁，采用差速 贴壁可纯化心肌细胞，适当延长贴壁时间可提高心 肌细胞分离的纯度。本实验将贴壁时间延长至 90 min，获 得 高 纯 度 的 心 肌 细 胞，同 有 关 报 道 相 一 致［4，5］。但此种 方 法 只 适 合 短 期 培 养，不 适 合 细 胞
2 结果 2． 1 心肌细胞的形态学观察 心肌细胞消化后呈 圆形，培养 24 h 后基本贴壁生长，可见少数细胞开 始搏动，节律不规则，搏动微弱，细胞呈梭形或多角 形，核多为 1 个或两个，核仁清楚。培养 48 h 后心 肌细胞搏动增强，立体感明显，折光性强。培养 3 d 后，细胞伸出伪足交织成网，形成放射状排列的细胞 簇（ 图 1 ） ，呈 同 步 性 收 缩，搏 动 细 胞 百 分 率 约 为 80% ～ 90% 。
2. 2） % 。结论： 以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高，是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。
大鼠原代心肌细胞培养实验的
相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
心肌细胞组织块法原代培养流程
心肌细胞组织块法原代培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养及荧光鉴定
岩， 张建华 ， 赵
勇
采用单纯胰蛋 白酶消化法分离 ， 差速贴壁法 纯化新生
液 等 自行 配置 。
大 鼠心肌细胞 。光学显微镜观察心肌细胞基本形态特征 ， 台
１ ． １ ． ３ 实验仪器 Ｚ Ｈ Ｊ Ｈ ． Ｃ １ １ １ ２ Ｂ超净工作 台（ 上 海智城公 司） ； Ｓ Ｍ Ａ Ｒ Ｔ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｃ Ｏ 培养箱 （ Ｈ ｅ ａ ｌ Ｆ ｏ ｒ ｃ ｅ
色法检测细胞成活率 达 ９ ０ ％ 以上 ； 肌钙蛋 白 Ｉ及 一 横 纹肌
肌动蛋 白免疫荧光染色法鉴定心肌细胞纯度达 ９ ８ ％ 以上 。
离心管 、 吸管 、 眼科剪 、 眼科镊等由本实验室提供 。
１ ． ２ 实验方 法
关键词
心肌细胞 ； 原 代培养 ； 新生大 鼠； 免疫 荧光
Ｒ ５ ４ ０ ． ４ ９
中图分类号
１ ． ２ ． １ 组 织 消化 和 细胞 分 离 配制 ０ ． １ ％胰酶 Ｄ －
文献标志码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １— ０ １ ２ ０— ０ ３
Ｈ ａ ｎ ｋ 缓冲液 ， 过滤除菌备用 ； 恒温磁力搅拌器预热
至３ ５～３ ７℃ 、 转速 ８ ０—１ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ； 取 出 生 １— ３日
・
１ ２ ０・
安徽 医科大学 学报
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ４ Ｊ ａ ｎ ； ４ ９ （ １ ）
新生 Ｓ Ｄ大 鼠心肌细胞 的原代培养及荧 光鉴定
姬婷婷 ， 徐
１ ． １ ． １ 实验动 物
大鼠原代心肌培养
新生大鼠原代心肌培养需高压消毒：工具盒：小转子；300目滤网×2；眼科剪（直剪×1，弯剪×2）；枪头盒（1mL、200μL、20μL）。
需提前配制并4⁰C预冷：D-Hank’s稀释的0.1%胰酶；加双抗的PBS。
1．麻醉与消毒：麻醉1-3天新生大鼠并用75%酒精浸泡消毒。
2．解剖：剪开胸腔，立即取出跳动的心脏并放入冰冷的PBS（加双抗）中，切取心室并转移到另一新鲜冰冷PBS中，初步洗去心室内的血液后将心室剪成1-3mm3的碎块，短暂离心几次，以去除红细胞。
注：所有操作在冰上进行。
注意防止污染。
红细胞会影响心肌细胞的贴壁。
3．预处理（20min）：将切碎的组织转移至0.1%胰酶溶液（0.5ml/1心脏）的40ml 培养瓶中（含转子，），置于冰上20min，每3min摇动一次。
注：这一步中使胰酶充分浸润组织块，以利于后续消化。
4．胰酶消化（15min）：将培养瓶置于37⁰C水浴15min，150-200rpm搅拌。
注：胰酶应为D-Hank’s配置，与PBS配置的相比，更利于心肌细胞的存活和贴壁。
5．吸取上清：将上步中的培养瓶斜放静置后，小心吸取上层的细胞悬液，移至50ml离心管（预先加入5-10ml含10%FBS的DMEM培养基）中，终止胰酶作用。
收集的细胞悬液置于4⁰C冰箱。
注：尽量吸取上清，不要吸到下层粘稠的DNA或者组织块。
6．重复消化：向培养瓶中补充胰酶，重复步骤4、5，直至组织块基本消化干净。
7．收集细胞：将所有上述收集的细胞悬液1000 rpm 5min收集细胞，将细胞种植于100mm培养皿中进行预贴壁培养。
8．细胞纯化（1.5-2h）：将步骤7中所得细胞培养1.5-2h以使非心肌细胞贴壁，然后将剩余细胞悬液以5×105个/ ml的密度种植于6孔板或100mm培养皿中，加BrdU至终浓度为0.1mmol/L，培养48小时以防止非心肌细胞增殖。
48小时后，更换不添加BrdU的DMEM培养基进行培养。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心血管疾病和心脏发育机制的重要模型。
在进行心肌细胞的分离鉴定和培养之前，我们需要准备以下实验材料和试剂：酶消化液、细胞培养基、大鼠心脏。
我们需要将大鼠处死，并将心脏取出。
取出的心脏需要立即放入含有乙醇消毒的PBS缓冲液中，以去除血液和外部污染物。
然后，将心脏移入无菌培养皿中，用PBS缓冲液冲洗数次，确保心脏表面干净。
随后，用取决于细胞类型和实验目的的酶消化液，如胰酶和胶原酶混合物溶液，对心脏进行消化。
消化时间可能需要根据实验目的的不同而有所差异，通常为30-60分钟。
在消化过程中，可以用显微镜观察和记录细胞的释放情况。
消化结束后，用完整培养基将消化产物传递到细胞培养皿中。
细胞培养皿需要经过预处理，用缺血的培养基包裹，并在37摄氏度的恒温培养箱中进行预暖。
将消化产物收集到离心管中，并用完整培养基进行离心，以去除酶消化液和细胞碎片。
离心结束后，将上清液抛弃，细胞沉淀用预热的完整培养基进行重悬。
通过显微镜观察细胞的形态和数量，并计算细胞的产量和存活率。
对于心肌细胞的鉴定，我们可以使用免疫荧光染色、流式细胞术等方法。
通过使用心肌标记物，如心肌肌动蛋白、酒石酸可溶性酸酐酶等，我们可以确保分离得到的细胞是心肌细胞而不是其他细胞类型。
在培养心肌细胞时，我们可以使用培养基中添加特定生长因子和血清的方法来促进心肌细胞的增殖和存活。
在培养过程中，需要定期更换培养基，并进行细胞观察和记录。
注意细胞的形态变化，如细胞肥大和收缩、形成心肌样结构等。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。
由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。
因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。
1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。
接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。
用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。
将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。
将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。
同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。
1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。
沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。
2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。
悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。
通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。
通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，可以用于研究心肌细胞的生理和病理过程。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养的步骤和注意事项。
一、心肌细胞的分离鉴定：1. 材料准备：- 大鼠心脏- 胰蛋白酶- 培养基（如DMEM/F12）- FBS（胎牛血清）- 抗生素（如青霉素/链霉素）- 生长因子（如胰岛素、培养基因素等）2. 心肌细胞的分离：- 用冰盐水冲洗大鼠心脏，将心脏置于0.1%胰蛋白酶溶液中，37℃恒温水浴放置15-20分钟。
- 取出心脏，去除杂质，用小孔濾网过滤，收集滤液。
- 加入预先冷却的培养基，离心分离细胞。
- 以适当的浓度重新悬浮心肌细胞。
3. 心肌细胞的鉴定：- 用显微镜观察细胞形态，心肌细胞的特点是形状呈纺锤形，具有交叉纹理。
- 心肌细胞可以用荧光染色的方法标记心肌肌纤维，如使用α-肌动蛋白标记。
- 用特异性抗体进行免疫染色，如心肌细胞特异性标志物肌球蛋白T (cTnT)。
2. 培养心肌细胞：- 将分离得到的心肌细胞在含10% FBS培养基的培养皿中培养。
- 培养皿放置于37℃恒温培养箱中，维持5% CO2的湿润环境。
- 每2-3天更换一次培养基，并观察细胞生长情况。
3. 细胞的凋亡和增殖：- 可以通过荧光染色，如使用Dapi染色观察细胞核形态来检测细胞凋亡。
- 可以使用CCK-8法或MTT法来测定细胞增殖情况。
4. 细胞的存活和形态观察：- 可以使用乙酰胆碱酯酶染色来观察细胞存活情况。
- 使用显微镜观察细胞形态的变化和生长状态。
总结：大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，在心脏病等相关研究中有着广泛的应用。
通过使用适当的培养基和条件，合理观察和分析细胞的形态和生理活性指标，可以用于研究心肌细胞的生理功能和分子机制，为心脏疾病的治疗提供基础和参考。
正常大鼠原代心肌细胞培养
正常大鼠原代心肌细胞培养一、实验试剂1、培养基：PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液：PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液：1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S4、染色液：0.4% Trypan Blue5、消化液：PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：一抗小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白，二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊5、200目网筛6、玻璃滴管7、烧杯8、15ml离心管三、实验流程取材↓取心肌组织放入D-Hanks中洗涤3次↓剪碎至1mm3 +消化液（PriCells）↓37℃水浴8min，吸弃上层悬液（非心肌细胞）↓余下组织加消化液（PriCells）37℃磁力搅拌10min，60r/min↓上层悬液加消化终止液（PriCells）↓余下组织再加消化液（PriCells）继续消化3-5次↓收集所有混悬液过200目网筛↓收集滤液1000RPM/10min↓去上清，收集沉淀，2ml培养基重悬↓染色计数四、实验操作1、培养瓶预包被。
试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：出生1—3天幼鼠。
3、材料预处理：将获取的心脏放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。
4、消化：将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上层混悬液遗弃；余下组织加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌10min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。
大鼠心肌细胞原代培养
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。
1.1.2主要仪器与试剂 5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。
1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。
于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏组织的主要细胞类型，对于研究心脏生理和病理具有重要意义。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养。
1.1 心肌细胞分离缓冲液的制备材料：胰酶（Sigma）胆汁酸（Sigma）肝素（Sigma）Krebs氏缓冲液（pH 7.4）制备：将1g胰酶、0.5g胆汁酸和10mg肝素混合后加入50ml Krebs氏缓冲液中，搅拌均匀，过滤，滤液称为酶液。
材料：大鼠心脏酶液Krebs氏缓冲液10% FBS器材：离心机冷藏离心管15ml离心管显微镜步骤：1）将新鲜大鼠心脏取出，迅速放入Krebs氏缓冲液中洗涤，去除残留的血液。
2）用冷Krebs氏缓冲液冲洗心脏3次，每次放入小的离心管中。
3）将心脏移入含有酶液的小离心管中，密封，放在离心机上，以适当的速度进行离心，细胞可保持在液体表面，离心时间约15分钟。
4）取出细胞上清，加入等体积的10% FBS，反复吹打分散心肌细胞。
5）收集细胞悬液，显微镜下观察细胞形态，统计细胞形态和数量。
6）以1×105个细胞/ml的浓度培养心肌细胞。
2. 心肌细胞的鉴定材料：FITC-α-肌球蛋白抗体Dil-α-肌球蛋白抗体显微镜步骤：1）将心肌细胞培养在玻片上，用50%乙醇固定，洗涤3次。
2）将细胞孔洞用Dil-α-肌球蛋白抗体标记，加入1/1000浓度的FITC-α-肌球蛋白抗体，封片，显微镜下观察合适的细胞，记录下为肌细胞转化的细胞数量，计算纯度。
材料：DMEM/F12培养基（Hyclone）10% FBS（Gibco）5% CO2孵育箱步骤：1）将心肌细胞密度调节至1×105个细胞/ml，加入10% FBS的DMEM/F12培养基，离心5分钟，移除上清液，加入完整培养基缓慢培养。
2）培养中周期观察心肌细胞的形态和数量，添加必要的药物，并及时更新培养基。
3）心肌细胞培养时间一般在3-5天，在适当的阶段进行下一步实验。
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养
３（ １ １ ）： ９ ６ ４—９ ６ ６ ．
作者简介 ： 张彤 ， 女， 副主任医师， 现工 作 于 山东 中医 药 大 学 附 属 医 院 （ 邮
编： ２ ５ ０ ０ １ １ ） ； 刘元峰 、 宋宪波， 工 作 于 山 东 中医 药 大 学 ； 苏文革 、 吴波 、 戴 国华（ 通 讯作 者 ） ， 工 作 于 山 东 中 医 药 大学 附属 医 院 （ 邮编 ： ２ ５ ０ ０ １ １ ） 。 （ 收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３—０ ４ —０ ３ ） （ 本 文 编辑 王 雅 洁 ）
［ ３ ］ Ｂ ｕ ｒ ａ ｓ ｈ ｎ ｉ ｋ ｏ ｖ Ａ， Ａｎ ｔ ｚ ｅ ｌ ｅ ｖ ｉ ｔ ｃ ｈ Ｃ ． Ｂ ｌ ｏ ｃ ｋ ｏ ｆ Ｉ （ Ｋｓ ）ｄ ｏ ｅ ｓ ｎ ｏ ｔ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ
ｅ ａ ｒ ｌ ｙ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｄ ｅ ｐ ｏ ｌ ａ ｒ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｂ ｕ ｔ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｓ ｂ ｅ ｔ ａ— ａ ｄ ｒ ｅ ｎ ｅ ｒ ｇ ｉ ｃ
ｖ ａ ｓ ｃ Ｅｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈｙ ｓ ｉ ｏ １ ． ２ ０ ０ ０， １ １ （ ４） ： ４ ５ ８—４ ６ ５ ．
平， 达 到 修 复 内皮 功 能 的 目的 ， 提 示 其 在 治 疗 心 肌 梗 死 等 严 重 缺 血 性 疾 病 中有 着 较 好 的应 用 前 景 ， 但其促进 Ｅ Ｐ Ｃ归 巢 到 心 肌 的
关键 词 ： 心肌细胞 ； 原代 培 养 ； 心肌细胞鉴定 ； Ａｃ ｔ ｉ ｎ免 疫 组 化
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏的主要细胞类型，负责心脏机械和电生理活动，对心脏健康具有重要的影响。
因此，研究心肌细胞具有重要的应用价值。
在本文中，将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。
1.1 心肌细胞的分离将大鼠心脏取出，用注射器将缓冲液（如PBS）注入主动脉，以清洗心脏内部的血液。
随后，将心脏移至一盛装有酶消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，肌肉组织被消化成单个细胞。
消化时间一般为20-30分钟，消化程度可以调整。
之后用培养液（如DMEM/F12）中和胰蛋白酶的酶消化液，使消化过程终止。
细胞分离后可以使用显微镜进行观察，同时也可以通过显微镜观察细胞形态来判断分离效果。
大鼠心肌细胞通常采用肌钙蛋白T的免疫荧光染色进行鉴定。
此外还可以使用心肌特异性的基因表达来鉴定心肌细胞。
通过PCR扩增，可以检测到只存在于心肌细胞中的基因，如心肌肌钙蛋白T和肌红蛋白等。
在培养前，需要先将心肌细胞分离、鉴定和计数。
以下是大鼠心肌细胞的培养方法：2.1 培养基适用于大鼠心肌细胞的培养基包括：DMEM/F12、M199、MEM、RPMI 1640等培养基，其中DMEM/F12和M199为常用培养基。
大鼠心肌细胞通常以静态培养为主，营养液一般为12%胎牛血清、5%马血清混合的DMEM/F12培养基。
细胞应在涂有胶原质的培养皿中培养。
培养室温度为37℃，5% CO₂的有利条件下培养。
此外，需要注意的是，心肌细胞对缺氧和低氧非常敏感，因此在培养过程中应始终维持培养皿内的氧气浓度。
通常情况下，大鼠心肌细胞的培养状态可以分为初代培养和传代培养。
初代培养的心肌细胞生长很快，但失去了心肌特异性表达，而传代培养中将保留心肌特异性的表达。
在传代培养时，需要定期检测细胞数量，并在细胞繁殖至80-90%时进行传代。
此外，传代时应注意保持培养基的组成和浓度的稳定，避免对细胞造成损伤。
总之，大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养对于心血管疾病研究具有非常重要的意义。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心脏功能的重要细胞模型。
对大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是进行心血管疾病研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的方法和步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 器材准备分离大鼠心肌细胞需要使用一些基本实验器材，包括离心机、显微镜、细胞培养箱、灭菌培养仪、移液器等。
还需要一些特殊器材，如细胞分离酶、细胞培养耗材等。
2. 细胞分离液的制备将适量的细胞分离液（比如包含胰酶和胰蛋白酶的消化液）配制好，根据具体的实验目的和所用试剂的浓度来调配。
3. 大鼠心脏的取样将需要的大鼠的心脏取出，迅速置于含有氧合液的离心管中，将其置于4°C的冰箱中等待使用。
4. 心肌细胞的分离将心脏组织放入离心管中，使用消化液进行酶解，经过一定时间的消化后，使用吸管或移液器将含有心肌细胞的上清液取出，用培养基冲洗数次，离心收集细胞。
5. 细胞的筛选用胶原酶进行细胞的预遴选，再用显微镜进行筛选。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定通过显微镜观察心肌细胞的形态结构，确定细胞形态是否符合心肌细胞的特征。
2. 免疫细胞化学染色使用心肌细胞特异性的标记物（如肌球蛋白、肌凝蛋白等）进行染色，观察细胞的染色情况，确定细胞的心肌细胞特异性。
3. 免疫细胞化学鉴定通过Western blot和免疫荧光染色等技术，对心肌细胞的标志性蛋白进行检测和鉴定，确保细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 细胞培养基的配制根据实验需要，配制适当的细胞培养基，为心肌细胞提供适宜的培养环境。
2. 细胞的培养将鉴定合格的大鼠心肌细胞转移到含培养基的培养皿中，放入细胞培养箱中进行培养，定期更换培养基，观察细胞的生长状态。
3. 细胞的传代当心肌细胞的密度适宜时，可以进行细胞的传代，将细胞分离并转移至新的培养皿中进行继续培养。
4. 细胞的应用经过培养的大鼠心肌细胞可以用于细胞生物学实验、药物筛选、毒性测试等领域的研究，为心血管疾病的研究提供重要的细胞模型。
原代心肌细胞分离 实验(体验版)
原代心肌细胞分离1 材料与方法1.1实验动物选择出生0.5-1天的清洁级SD新生大鼠，雌雄不限1.2主要的实验仪器CO2恒温培养箱；倒置显微镜；Nikon-E440荧光显微镜胰酶；Ⅱ型胶原酶；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）；肌球蛋白重链蛋白（MF-20）单克隆抗体（武汉博士德公司）;Hoechest；无钙镁磷酸盐缓溶液；胎牛血清（FBS）；氯霉素+新链霉素溶液I 15ml（DMEM-F12 13.5ml，FBS1.5ml，氯霉素+新链霉素150ul）溶液II 30ml（DMEM-F12 25.5ml，FBS4.5ml，氯霉素+新链霉素300ul,BrdU 100ul 10mg/ml）新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶（0.01g粉末+ 10ml PBS 0.2um过滤器过滤）1.3大鼠心肌细胞分离和培养于超净工作台中，取新生1-2天SD大鼠10只，75%酒精溶液浸泡3-5s杀菌消毒。
更换器械于无菌条件下立即打开胸腔,准确取出心脏,放于预冷的无钙镁磷酸盐缓溶液中漂洗5次，并依次去除心脏周围及心脏房室腔内的血液或血凝块，剪去心房部分，获取心尖心室部分，迅速转移至200ul预冷的0.1%胰酶的无钙镁磷酸盐缓液中，将心肌组织反复剪成约0.5-1 mm3的组织块，将剪碎的组织块混合液转移到50ml的离心管中静置于冰箱4℃消化过夜（每隔段时间摇晃一下）。
第二日，配置新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶10ml（0.2um过滤器过滤），置换等量心脏消化液，于磁力搅拌器上温和搅拌消化30min，温度34℃，转速100-120g。
待消化液中组织块全部消化完时，加入10ml溶液I终止消化，1500rpm离心10min,小心弃去上清，加入5ml溶液I，1500rpm离心5min，小心弃去上清，加入溶液II 10ml(含0.1 mmol/L BrdU，以抑制成纤维细胞的增殖)，轻轻吸打混匀后400目细胞筛过筛入10cm大皿中，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，差速贴壁培养2h。
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相关记录：年月日星期天气：
实验内容：C57小鼠心肌细胞培养
参加人员：王朗郭源源
一、培养前准备：
1 器械：
取心脏：wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把
取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、
400目细胞滤网
2 器皿：
外：烧杯1个100ml
内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，
碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml
离心管
3 试剂及配制
1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS
2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷100X储备液(10 mM)，小牛血清、II型
胶原酶（10mg/ml储备液）、0.25%胰酶提前融化
3.D-Hanks液：
4.酶消化液：酶终浓度：2型胶原酶0.5mg/ml，胰酶0.15mg/ml
40ml：胰酶1.2ml，胶原酶2ml，D-HANKS 36.8ml
二方法
1 心脏取出
1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿
放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸
泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部
剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让
心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃
平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的
10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞
1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，加入酶消化液
4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以及心内膜和心外膜
细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml（体积为上清液体积的2-3倍）含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
5. 将收集好心肌细胞悬液3管，以1000rpm转速离心5min，小心倒掉上清液，在一管中加入3ml培养基，轻柔吹打重悬细胞，再转到另一管，将各管细胞集中至1个15ml离心管中，轻柔混匀。
3 差时贴壁：
1.将细胞悬液经细胞40um过滤网过滤，以滤去细胞团块，用2ml培养基冲洗滤膜。
2.将细胞接种在10mm的培养皿中进行差时贴壁70min。
3. 用0.1%明胶包被六孔板的5个孔
4. 培养皿中加入1ml培养基，清洗培养皿将沉于皿底但未贴壁的心肌细胞重悬，并转入到上述15ml离心管中。
5. 在原皿中加入含10%FBS的DMEM/F12培养基3ml 继续培养心脏成纤维细胞。
6. 在心肌细胞悬液共5ml加入Brdu 50ul终浓度（0.1mM）轻柔混匀之后，以每孔3ml加入到包被好的孔中。
7. 每个皿均按照南北方向、东西方向轻摇以分散细胞，勿漩涡摇晃。
5. 37度5%二氧化碳,静置培养48-72小时后用培养基洗涤1次，更换培养基，并加Brdu。