荧光显微镜的基本原理及应用
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1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光
减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射 标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短 时间内反复开关，标本应集中观察。） 4 载物台前方黄色遮光板：最好不直接用肉眼看激发 光，以防短波光中的紫外伤害。 5标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱 。
2020/3/28
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2020/3/28
二、荧光显微镜的组成
1、光源：一般采用高压汞灯 2、滤色系统：由激发滤板和压制滤板组成 a、激发滤板：提供一定范围的激发光 b、压制滤板：完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围荧光 3、反光镜：一般采用平面反光镜 4、聚光镜：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成 5、物镜和目镜
4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细 胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒体 进行特异的结合。
2020/3/28
六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因 此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常 出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰 竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进 行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一 ，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素 的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是 由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
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五、荧光染料的使用
1、吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它 可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色 的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。 2、溴化乙锭（EB）:染色DNA和RNA。 3、荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极 性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由 于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素 。
高分辨率荧光显微镜的基本原理和 操作要求
2020/3/28
2020/3/28
一、荧光显微镜(fluorescence microscope)
原理： 某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后 ，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其 从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量 或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出 来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的 光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光 部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一 定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的 比照射光波长更长的可见光。
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光 的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用 甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液 作封裱剂。 （五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使 用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油 代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量 略有影响。
immunofluorescent technique)”。
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由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出 ，从而可对抗原进行细胞定位
2020/3/28
百度文库
• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
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The optical system of a fluorescence microscope.
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
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2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号 传导中信号分子的迁移功能， 将一荧光蛋白与信号分子相偶 联，根据荧光蛋白的分布情况 即可推断信号分子的迁移状况 ，并推断该分子在迁移中的功 能。由于GFP分子量小，在活 细胞内可溶且对细胞毒性较小 ，因而常用作荧光探针
2020/3/28
八、使用注意事项
2020/3/28
七、荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的
物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技 术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接 ，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免 疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。用荧 光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合 体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect
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三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
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(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如 TRITC)。
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
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（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分 消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发 。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
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四、荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片 载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚
的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁 ，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用 石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片
2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光
减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射 标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短 时间内反复开关，标本应集中观察。） 4 载物台前方黄色遮光板：最好不直接用肉眼看激发 光，以防短波光中的紫外伤害。 5标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱 。
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二、荧光显微镜的组成
1、光源：一般采用高压汞灯 2、滤色系统：由激发滤板和压制滤板组成 a、激发滤板：提供一定范围的激发光 b、压制滤板：完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围荧光 3、反光镜：一般采用平面反光镜 4、聚光镜：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成 5、物镜和目镜
4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细 胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒体 进行特异的结合。
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六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因 此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常 出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰 竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进 行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一 ，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素 的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是 由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
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五、荧光染料的使用
1、吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它 可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色 的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。 2、溴化乙锭（EB）:染色DNA和RNA。 3、荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极 性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由 于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素 。
高分辨率荧光显微镜的基本原理和 操作要求
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一、荧光显微镜(fluorescence microscope)
原理： 某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后 ，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其 从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量 或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出 来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的 光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光 部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一 定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的 比照射光波长更长的可见光。
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光 的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用 甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液 作封裱剂。 （五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使 用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油 代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量 略有影响。
immunofluorescent technique)”。
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由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出 ，从而可对抗原进行细胞定位
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百度文库
• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
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The optical system of a fluorescence microscope.
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
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2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号 传导中信号分子的迁移功能， 将一荧光蛋白与信号分子相偶 联，根据荧光蛋白的分布情况 即可推断信号分子的迁移状况 ，并推断该分子在迁移中的功 能。由于GFP分子量小，在活 细胞内可溶且对细胞毒性较小 ，因而常用作荧光探针
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八、使用注意事项
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七、荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的
物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技 术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接 ，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免 疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。用荧 光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合 体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect
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2020/3/28
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三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
2020/3/28
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如 TRITC)。
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
2020/3/28
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分 消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发 。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
2020/3/28
四、荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片 载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚
的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁 ，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用 石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片