凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾

凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾

一、实验目的：

1、掌握凝胶层析技术的原理及分子筛分离不同组分原理；

2、熟悉凝胶过滤法的操作步骤。

二、实验原理：

1、凝胶过滤层析：是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析；

2、分子筛效应:高铁血红蛋白的大分子不能进入葡聚糖孔径，只能在晶体与晶体的间隙中随缓冲液流动相下移，速度较快，高铁氰化钾为小分子物质，在葡聚糖三维结构中，速度较慢；

3、血红蛋白(Hb,Mw=64,500)加入过量的K 3Fe(CN)6(Mw=329.25)，形成高铁血

红蛋白(MetHb)。为了去掉多余的K 3Fe(CN)6，并得到较纯的MetHb 样品，将上述

混合物通过交联葡萄糖G-50的凝胶滤柱，用pH7.0的磷酸缓冲液洗脱，使它们相互分离。从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子K3Fe(CN)6(黄色)洗脱较慢，然后分别收集。

将凝胶过滤后收集的MetHb 溶液装入透析袋。MetHb 溶液中含有磷酸盐，经过透析使前者脱盐，而MetHb 保留在透析袋内。用钼酸铵和氨基萘酚磺酸试剂进行磷的定性，用15%三氯醋酸的沉淀反应鉴定蛋白质。

三、实验步骤：

1.装柱 取层析柱一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，把柱底烧结玻璃上、下方的气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液至5cm 高，将平衡后的交联葡聚糖G-50悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入G-50悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm 左右时为止。 (NH 4)2MoO 4 + H 2SO 4 → H 2MoO 4 + (NH 4)2SO 4

H 2MoO 4 + H 3PO 4 → H 3PO 412MoO 3 + H 2O

H 3PO 412MoO 4 + H 2N-C 6H 5(OH)SO 3H → Mo 2O 3 + 钼兰

2.平衡床面上约盖5ml的缓冲液，关闭出口，使层析柱稳定 5 分钟后，接储液瓶。打开出口，用2 倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。

3.样品的处理 3 滴溶血液加8 滴K

3F(CN)

6

混合，制成MetHb混合样品。

4.上样打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关

闭出口。用滴管吸取约0.5ml混合物样品，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿扰动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。

5.洗脱同上加入1-2 倍样品量体积的洗脱液，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿扰动床面凝胶，接储液瓶进行洗脱，先洗壁。

6.观察、收集观察柱上的色带，收集红褐色的MetHb 色带后，继续洗脱待

黄色的K

3F(CN)

6

色带完全洗脱下来后，关闭出口。回收凝胶。

7.透析把透析袋、橡皮筋放在盛有蒸馏水的烧杯内浸湿，用橡皮筋扎紧透析的一端，然后用滴管吸取MetHb洗脱液装入袋内，约装入4ml左右，扎紧袋的另一端，取小烧杯一个加40ml 蒸馏水，按下列两表分别取出杯内蒸馏水，各自加入干净试管，留作对照。然后将装好样品的透析袋悬入杯内蒸馏水中。打开磁力搅拌器，调至适当的速度，透析20 分钟。

8.鉴定磷酸盐、蛋白质的鉴定操作按以下两表，观察和记录结果，并解释之。

四、结果与分析：

1.凝胶层析：

层析现象：刚开始时柱内为白色透明缓冲液。加入样品后不久，看到柱内上方有颜色分层，上层为黄色（K 3F(CN)6），下层为红褐色（MetHb ）。再过一段时间，

柱内红褐色与黄色之间距离越来越大，两者中间为白色缓冲液试管。试管中收集到红褐色溶液，且颜色逐渐变深。收集完红褐色溶液后，

柱内只剩白色缓冲液和凝胶层析效果

较上面的黄色溶液，黄色慢慢下来，也全部回收。到最后，柱内又只剩白色透明缓冲液。

2.磷酸盐、蛋白质的鉴定（如上图所示）：

（1）磷酸盐鉴定：加入钼酸铵和氨基萘酚磺酸试剂后，透析前杯内蒸馏水无变化；而透析后杯内蒸馏水变成蓝色，说明产生了钼兰。

（2）蛋白质鉴定：加入15%三氯醋酸试液后，透析前、后杯内蒸馏水均无变化；而透析袋内溶液产生红褐色沉淀。

五、讨论

1.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。

2.要始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干，造成实验失败。同时也会使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变差，不得不重新装柱。

3.操作过程中，若层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正，否则达不到分离效果。

4.凝胶、透析袋都应回收利用，不可随意丢弃。

六、结论

1.通过凝胶过滤层析，相对分子量较大的MetHb直径大于凝胶网孔，流程较

短,移动速度快，首先流出；相对分子量较小的K

3F(CN)

6

直径小于凝胶网孔，在

向下移动过程中流程较长，移动速度慢，较后流出。

2.通过磷酸盐、蛋白质的鉴定，说明磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径，能够穿过透析袋;而蛋白质是大分子，不能透过透析袋，只能保留在袋中。